Обнаружение единичных нуклеотидных замен в ДНК: расщепление РНКазой и денатурирующий градиентный гель-электрофорез
4. Инкубируйте смесь 60 мин при 40–45°С, чтобы произошла реассоциация между зондом и комплементарными ему последовательностями в тестируемом фрагменте геномной ДНК.
Примечание: по оригинальной методике гибридизацию проводят в течение 10–12 ч. Считается, что за это время реакция реассоциации между фрагментами геномной ДНК и РНК-зондом достигает насыщения. В клонированных и амплифицированных в ПЦР фрагментах геномной ДНК доля последовательностей-мишеней намного больше, поэтому время гибридизации можно значительно уменьшить. Сокращение сроков инкубации облегчает проведение эксперимента и уменьшает деградацию зонда. 5. Добавьте 350 мкл смеси РНКазы с РНКазным буфером. Как следует перемешайте встряхиванием. Эта смесь представляет собой буфер для РНКазной реакции с разведенной в нем до концентрации 40 мкг/мл прокипяченной РНКазой А и тРНК-носителем в концентрации 20 мкг/мл. Раствор можно приготовить за несколько часов до использования и хранить во льду. На 5 мл смеси надо 5 мл буфера для РНКазной реакции, 100 мкл исходного раствора прокипяченной РНКазы А, 20 мкл тРНК. Примечание: в большинстве наших опытов по РНКазному расщеплению концентрация РНКазы А была 40 мкг/мл. Однако, используя фермент из другой партии, мы обнаружили, что эта концентрация слишком велика – фермент в таком количестве разрушал гибриды РНК – ДНК – Положительных результатов удалось достичь, снизив его концентрацию до 4 мкг/мл. Поэтому мы рекомендуем каждую новую партию РНКазы перед использованием калибровать в пределе концентраций от 2 до 40 мкг/мл. Для калибровки желательно использовать как мутантный контрольный образец, так и контрольный образец дикого типа. В оптимальной концентрации РНКаза А эффективно расщепляет неспаренные участки в мутантном образце и дает фоновый сигнал в контроле дикого типа.
6. Инкубируйте 60 мин при 25°С.
Примечание: по оригинальной методике инкубацию проводили в течение 30 мин. За это время РНКаза А расщепляет многие неспаренные участки лишь частично, что приводит к появлению радиоактивных сигналов в участках геля, соответствующих фрагментам дикого типа. При более длительной обработке удается расщепить эти уже частично расщепленные РНКазой сайты полностью. Легче всего интерпретировать результаты РНКазной обработки, отбирая в процессе реакции аликвоты после 30, 60 и 90 мин инкубации. В ряде случаев полуторачасовая обработка бывает чрезмерной и приводит помимо прочего к деградации концевых областей фрагментов РНК. Поэтому если кинетика реакции не исследована, то оптимальным временем обработки следует считать примерно 60 мин.
7. Остановите РНКазную реакцию добавлением 10 мкл ДСН и 10 мкл протеиназы К. Инкубируйте 30 мин при 37°С.
8. Добавьте 10 мкг тРНК-носителя.
9. Экстрагируйте реакционную смесь один раз фенолом и один раз 2 FC. После первой экстракции осторожно отберите только 300 мкл верхнего водного слоя автоматической пипеткой с пластиковым наконечником и перенесите в другую пробирку. Делается это, чтобы не допустить попадания РНКазы из интерфазы между водным слоем и фенолом.
10. Осадите нуклеиновые кислоты этанолом. Промойте осадок 70%-ным этанолом и высушите.
11. Ресуспендируйте осадок РНК в 10–20 мкл насыщенного раствора формамида. Иногда бывает трудно полностью перерастворить РНК в формамиде. Чтобы ускорить процесс, пипетируйте раствор несколько раз при помощи автоматической пипетки с пластиковым наконечником.
4.2.3 Анализ
1. Перед нанесением образцов проведите преэлектрофорез в течение 1–2 ч.
2. Прогрейте образцы 4 мин на водяной бане при 95–100°С, чтобы разделить РНК- и ДНК-цепи.
3. Отключите источник питания и отсоедините электроды.
4. Перед внесением образца в лунку промойте ее при помощи капиллярной автоматической пипетки или шприца для подкожных инъекций.
5. 5 мкл образца непосредственно из водяной бани перенесите быстро в лунку геля. Быстро продолжайте процедуру, пока не нанесете все образцы.
6. Присоедините клеммы к аппарату для электрофореза, снова включите источник питания. Проводите электрофорез при 15–20 В до тех пор, пока бромфеноловый синий не достигнет края геля.
7. После окончания электрофореза отключите источник питания, отсоедините клеммы, выньте пластины с гелем из установок. Высушите гель на листе ватмановской бумаги 1 ММ или ее аналога и экспонируйте с.рентгеновской пленкой. Примечание: экспозицию геля с рентгеновской пленкой можно проводить без высушивания. Преимущество высушивания в том, что оно увеличивает разрешающую способность.