Xreferat.com » Рефераты по биологии » Рекомбинантные вакцины (Генная инженерия)

Рекомбинантные вакцины (Генная инженерия)

ОГЛАВЛЕНИЕ


Введение………………………………………………………………………………………….3

  1. Принципы конструирования рекомбинантных противовирусных вакцин…………..4-24

    1. Получение соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты……………....….4

    2. Выбор высокоактивной и хорошо изученной в иммунологическом отно-

шении модели вектора-носителя и клонирование соответствующего гена……9-21

      1. Получение рекомбинантных ДНК……………………………………………9

      2. Получение рекомбинантных РНК…………………………………………...11

      3. Стратегия клонирования генов………………………………………….…13

      4. Разнообразие векторных молекул…………………………………………17

    1. Выбор системы экспрессии клонированного гена, способной обеспечить

максимальный выход и функциональную полноценность продукта……………..22

    1. Создание достаточно удобных и по возможности универсальных векторов

для целевой доставки генов в клетки и ткани организма…………………………23

  1. Вакцина против лейкемии кошек, изготовленная с помощью генной

инженерии……………………………………………………………………………….…24

Список литературы…………………………………………………………………………….26


ВВЕДЕНИЕ


Существующие традиционные вакцины, несмотря на очевидный положительный эффект их широкого применения, обладают рядом недостатков. К ним относятся: наличие нежелательных биологически активных и балластных компонентов в препаратах, неполноценные иммунологические свойства самих антигенов. Кроме того, существуют заболевания, не вызывающие иммунитета, вакцины против которых вообще отсутствуют и не могут быть сконструированы на основе классических принципов. Все это вызывает необходимость усовершенствования уже существующих вакцин и создания принципиально новых типов вакцин. Одним из наиболее перспективных направлений в данной области является получение вакцинных препаратов на основе методов генной инженерии.

Последним достижением генной инженерии и биотехнологии стало создание рекомбинантных противовирусных вакцин, содержащих гибридные молекулы нуклеиновых кислот. Данные вакцины обладают целым рядом преимуществ. Они характеризуются отсутствием (или значительным снижением) балластных компонентов, полной безвредностью, низкой стоимостью, которая связана с удешевлением промышленного производства вакцин. Экспрессируемый в клетках вакцинированного животного белок имеет конформацию, близкую к нативной, и обладает высокой антигенной активностью.

Таким образом, рекомбинантные противовирусные вакцины являются новейшим поколением вакцин. Их очевидное преимущество обуславливает широкое применение данного типа вакцин в медицине и ветеринарии для вакцинации населения и сельскохозяйственных животных.


1. ПРИНЦИПЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ВАКЦИН


Важным условием получения эффективного вакцинного препарата является соблюдение основных принципов его производства. Конструирование рекомбинантных противовирусных вакцин предполагает: 1) получение соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты; 2) выбор высокоактивной и хорошо изученной в иммунологическом отношении модели вектора-носителя и клонирование соответствующего гена (или генов); 3) выбор системы экспрессии клонированного гена, способной обеспечить максимальный выход и функциональную полноценность продукта; 4) создание достаточно удобных и по возможности универсальных векторов для целевой доставки генов в клетки и ткани организма.


1.1. ПОЛУЧЕНИЕ СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ФРАГМЕНТА

НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ


Для конструирования рекомбинантных РНК или ДНК необходимо получить фрагмент нуклеиновой кислоты, который в дальнейшем и будет встраиваться в векторную молекулу.

Фрагменты ДНК для встраивания в вектор можно получить непосредственно из хромосомной ДНК, расщепив ее рестриктазами или разрушив случайным образом (например, с помощью ультразвука) на сегменты с примерно одинаковой длиной. Выделение генов с помощью "вырезания" из генома, как правило, состоит из четырех этапов: 1) получение клонотеки фрагментов генома; 2) выявление фрагментов генома, содержащих необходимый ген, и точная локализация гена в данном фрагменте; 3) вырезание гена из фрагмента(ов) с помощью рестриктаз и сшивка участков гена с помощью ДНК-лигазы фага Т4, если эти участки получены из различных фрагментов; 4) амплификация гена в составе векторной молекулы. Указанный способ получения генов является наиболее приемлимым применительно к протозойным возбудителям, бактериям и для некоторых сложно устроенных ДНК-содержащих вирусов. Такие операции проводятся, в частности, при создании так называемых "библиотек генов", то есть набора одинаковых векторных систем, в совокупности несущих в себе весь геном данного организма. Однако этот подход имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, очень сложна задача подбора рестриктаз, позволяющих вырезать из геномной ДНК или клонированного фрагмента генома цельный ген. Как правило, вместе с геном остаются фланкирующие его лишние нуклеотидные последовательности, что мешает дальнейшему использованию этого гена, или же рестриктазы отрезают часть гена, делая его функционально неполноценным. Во-вторых, создание клонотеки генома возбудителя представляет специальную задачу и требует больших затрат времени. Наконец, для ряда ДНК-содержащих вирусов (паповавирусы) доказан сплайсированный характер структуры генов. Вполне понятно, что выделенные гены этих вирусов вследствие наличия интронных областей не будут проявлять функциональной активности в бактериальных клетках и окажутся непригодными при решении задач по конструированию рекомбинантных противовирусных вакцин. В-третьих, если ген составляет незначительную долю от всей геномной ДНК, то возникают большие трудности с его изоляцией и идентификацией.

Наиболее распространенным является путь получения генов через синтез ДНК-копий (кДНК) информационных или каких-либо других (в оптимальном случае - индивидуальных) РНК путем их обратной транскрипции. Данный способ включает в себя три этапа: 1) выделение высокоочищенных мРНК, кодирующих индивидуальные структурные белки, либо выделение геномных РНК вирусов; 2) синтез двухцепочечной ДНК (гена) на матрицах РНК; 3) амплификация гена с помощью методов молекулярного клонирования.

Как отмечалось, первым этапом в получении генов с помощью методов обратной транскрипции служит выделение и очистка геномных РНК и мРНК. Геномные РНК выделяют главным образом из очищенных вирионов, а мРНК - из инфицированных клеток. Для выделения мРНК из инфицированных клеток используют различные способы. В одном из вариантов выделение мРНК из инфицированных клеток проводят непосредственно из лизированных клеток (лизис осуществляют в денатурирующих средах в целях предотвращения разрушающего действия нуклеаз на мРНК) с последующей экстракцией фенолом и хлороформом или центрифигурированием лизата через подушку 5,7M СsCl (для освобождения от клеточных ДНК) и заключительной аффинной хроматографией на олиго(dТ)-целлюлозе (поли(У)-сефарозе). Выделение мРНК можно проводить и из очищенных полирибосом инфицированных клеток.

В случае необходимости получения специфических мРНК, ко­дирующих индивидуальные структурные белки возбудителя, исполь­зуют следующий способ. Инфицированные вирусом клетки разрушают механическим путем или химическими методами (использование неионных детергентов). Клеточный лизат освобождают от ядер и митохондрий методом диф­ференциального центрифугирования и подвергают хроматографии на антительном сорбенте. При этой процедуре с антителами, специ­фичными к определенному структурному белку возбудителя, связы­ваются полисомы, осуществляющие синтез этого белка. Также может быть использован метод непрямой иммунопреципитации полисом, при котором комплекс антитело - полисома преципитируется из раствора добав­лением второго антитела, специфичного к первому. В качестве второ­го антитела чаще всего берут фиксированные формалином клетки Staphilococcus aureus, на поверхности которых находится так назы­ваемый белок А, имеющий сродство к Fc-фрагментам Ig. Из полисом, полученных одним из описанных способов, далее уже выделяют мРНК.

Другой путь выделения индивидуальных мРНК базируется на свойстве мРНК взаимо­действовать с комплементарными ДНК, связанными с твердым носи­телем (целлюлоза, сефароза, нитроцеллюлозные фильтры). Этот ме­тод отбора и очистки специфических мРНК является самым эффективным. Однако его применение возможно только при наличии соответст­вующих комплементарных ДНК.

Получение препарата очищенной мРНК позволяет перейти к ра­ботам по синтезу гена с помощью обратной транскрипции, которую осуществляют с помощью ревертазы AMV в специально подобран­ных условиях. В процессе обратной транскрипции матрицей служит мРНК, а затравкой олиго(dT12-18) (для мРНК, имеющих поли(А)-тракт) или химически синтезированный олигонуклеотид, комплемен­тарный 3'-концу мРНК. После синтеза на мРНК компле­ментарной цепи ДНК и разрушения РНК (чаще используется обра­ботка щелочью) осуществляют синтез второй цепи ДНК. В этой реакции матрицей служит первая цепь ДНК. Реакция может катали­зироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой.

После получения двухцепочечной кДНК следует стадия получения гена, заключающаяся в гидролизе одноцепочечного участка ДНК, соединяющего первую и вторую цепи, нуклеазой S1.

Для получения необходимых участков РНК используют две группы способов: 1) расщепление полирибонуклеотидной цепи РНК в заданном месте; 2) синтез РНК (ферментативный на ДНК- или РНК-матрицах и химический).

Расщепление полирибонуклеотидной цепи РНК может осуществляться в присутствии различных ферментов. Для этой цели используют ферменты: рибонуклеазу H, нуклеазы, ковалентно связанные с олигонуклеотидами (например, стафилококковая нуклеаза), рибозимы (например, рибозим L-19).

Исторически первым способом направленной ферментативной фрагментации РНК (называемой также адресованной, сайт-направленной или сайт-специфической фрагментацией РНК) является разработанный в Московском университете метод гидролиза РНК ферментом РНКазой H в присутствии комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов. Этот метод до сих пор остается наиболее универсальным способом направленной фрагментации РНК.

Метод основан на свойстве РНКазы Н расщеплять полирибонуклеотидную цепь РНК в составе ДНК-РНК-гетеродуплекса. К участку РНК, по которому планируется провести ее фрагментацию, синтези­руется комплементарный олигодезоксирибонуклеотид длиной в 6-10 нуклеотидных остатков. Далее получают комплекс этого олигонуклеотида с РНК, который затем обрабатывают ферментом. В работе обычно используют РНКазу Н из Escherichia coli - вполне доступный фермент, который может быть довольно легко очищен от всех сопутствующих нуклеазных примесей. Этот метод нашел достаточно широкое применение для сайт-специфического расщепления вирусных и рибосомных РНК, а также для иден­тификации продуктов процессинга некоторых РНК.

Важным достоинством рассматриваемого метода является и то, что в результате гидролиза РНК рибонуклеазой Н образуются фраг­менты, у одного из которых на 5'-конце содержится фосфатная группа, а у другого 3'-конец свободен (нефосфорилирован). Такие фрагменты можно прямо использо­вать в реакции ферментативного лигирования.

Серьезным ограничением этого метода является то, что участок РНК, с которым связывается комплементарный ему олигодезоксири­бонуклеотид, должен иметь однотяжевую конформацию и находиться на поверхности макромолекулы РНК, представляющей собой в усло­виях расщепления компактную глобулу с развитой вторичной струк­турой. В отдельных случаях это ограничение удается преодолеть, ис­пользуя достаточно длинные олигодезоксирибонуклеотиды (15-20-членные), которые предварительно отжигают с частично или полно­стью денатурированной РНК.

Другое ограничение метода фрагментации полирибонуклеотидов РНКазой Н в присутствии комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов заключается в том, что в общем случае предсказать, какая из фосфодиэфирных связей в гетеродуплексе (или в непосредственной близости от него) подвергнется расщеплению, не удается. Более того, фермент зачастую гидролизует не одну, а несколько соседних межнуклеотидных связей. Ясно, что для последующего конструирования рекомбинантных РНК такие фрагменты могут оказаться непригодными.

Расщепление РНК может проводиться и с участием нуклеаз, ковалентно связанных с олигонуклеотидами. Идея, лежащая в основе данного подхода к направленной фрагментации РНК, восходит к концу 60-х годов, когда Н. И. Гриневой и ее сотрудниками был предложен метод олигонуклеотид-направляемой модификации нуклеиновых кислот. Принцип этого метода заключается в том, что с 5'- или 3'-концевым остатком олигонуклеотида, комплементарного заданному району ДНК и РНК, связывают модифицирующий агент, который после образования дуплекса атакует одно из ближайших к нему оснований. Реагентами этого типа удалось направленно фрагментировать фенилаланиновую тРНК из дрожжей, РНК-компонент (M1 РНК) РНКазы Р, а также 16S рибосомную РНК E.coli.

Однако, как и в случае РНКазы Н, расщепление РНК олигонуклеотид-нуклеазой зачастую проходит по нескольким межнуклеотидным связям, что несколько ограничивает возможности применения этого метода для получения рекомбинантных РНК.

Для расщепления РНК применяют также рибозимы (природные РНК и синтетические полирибонуклеотиды, способные катализировать целый ряд превращений у других РНК). Первый рибозим, напоминающий по своим свойствам эндонуклеазы рестрикции, был получен Т. Чеком. В научной литературе его обозна­чают как рибозим L-19. Этот рибозим представляет собой РНК длиной в 395 нуклеотидных остатков, в 5'-концевой области которой имеется гексануклеотидная последовательность GGAGGG, ответст­венная за специфичность расщепления предшественника 26S РНК при самосплайсинге. Эта последовательность комплементарна CUCUCU последовательности, расположенной на 3'-конце первого экзонного участка предшественника 26S РНК. Если эту РНК заменить другой, но обязательно содержащей доступную для комплементарного связывания CUCUCUA последовательность, то рибозим L-19 в присутствии гуанозина или гуаниловых нуклеотидов со свободной 3'-гидроксильной группой расщепит ее.

Источником необходимых участков РНК может служить такой способ, как синтез фрагментов РНК. Ферментативный синтез сегментов РНК осуществляют с использованием разнообразных генно-инженерных конструкций. Однако в настоящее время в подавляющем большинстве случаев для препаративного получения РНК используются РНК-полимеразы, закодированные в геномах ряда ДНК-содержащих бактериофагов (Т3, Т7 и SP6). Они характеризуются очень высокой активностью и, в отличие от клеточных РНК-полимераз, состоят из одной полипептидной цепи. Важно также то, что инициация и терминация синтеза РНК этими полимеразами происходит на одном определенном нуклеотидном остатке.

Полученные одним из способов фрагменты нуклеиновых кислот в дальнейшем встраивают в векторные молекулы.

Подводя итог изложенному, можно сделать вывод, что получение генов протективных белков возбудителей представляет собой достаточно сложную задачу. Однако ее решение необходимо для создания в конечном счете рекомбинантных противовирусных вакцинных препаратов.


1.2. ВЫБОР ВЫСОКОАКТИВНОЙ И ХОРОШО ИЗУЧЕННОЙ В

ИММУНОЛОГИЧЕСКОМ ОТНОШЕНИИ МОДЕЛИ ВЕКТОРА-НОСИТЕЛЯ И КЛОНИРОВАНИЕ СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ГЕНА

1.2.1. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК


Суть конструирования рекомбинантных ДНК заключается во встраивании фрагментов ДНК, среди которых находится интересую­щий нас участок ДНК, в так называемые векторные молекулы ДНК (или просто векторы) - плазмидные или вирусные ДНК, которые могут быть перенесены в клетки про- или эукариот и там автономно репли-цироваться. На следующем этапе проводится отбор тех клеток, кото­рые несут в себе рекомбинантные ДНК (с помощью маркерных призна­ков, которыми обладает сам вектор), и затем индивидуальных клонов с интересующим нас сегментом ДНК (используя признаки или пробы, специфичные для данного гена или участка ДНК).

При решении ряда научных и биотехнологических задач конст­руирование рекомбинантных ДНК требует также создания систем, в которых обеспечивается максимальная экспрессия клонируемого гена.

Существует три основных способа встраивания чужеродной ДНК в векторные молекулы. В первом случае 3'-концы фрагментов ДНК, среди которых находится интересующий нас участок ДНК (ген или его сегмент, регуляторный район), с помощью фермента терминальной нуклеотидилтрансферазы наращиваются гомополинуклеотидной последовательностью (например, поли (Т)). 3'-концы ли­нейной формы векторной ДНК тем же способом наращиваются комп­лементарной ей гомополинуклеотидной последовательностью (то есть по­ли (А)). Это позволяет соединить две молекулы ДНК путем комплемен­тарного спаривания искусственно полученных "липких" концов.

Во втором случае "липкие" концы создаются с помощью расщеп­ления молекул ДНК (как векторной, так и содержащей интересующий нас фрагмент) одной из эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). Рестриктазы характеризуются исключительно высокой специ­фичностью. Они "узнают" в ДНК последовательность из нескольких нуклеотидных остатков и расщепляют в них строго определенные межнуклеотидные связи. Поэтому даже в ДНК больших размеров рестриктазы вносят ограниченное число разрывов.

Третий способ представляет собой комбинацию двух первых, когда липкие концы ДНК, образованные рестриктазой, удлиняются синтетическими последовательностями (рис. 1).

Концы фрагментов ДНК можно превратить в "липкие", наращи­вая их двутяжевыми олигонуклеотидами ("линкерами"), в состав кото­рых входит участок узнавания рестрикта-

Рисунок 1. Схема конструирования рекомбинантной ДНК с помощью рестриктаз PstI и поли(G)- поли(С)-линкера.


зой. Обработка такого фраг­мента данной рестриктазой делает его пригодным для встраивания в векторную молекулу ДНК, расщепленную той же рестриктаэой. Часто в качестве "линкера" применяются полинуклеотидные фрагменты, ко­торые содержат специфические участки сразу для нескольких рестриктаз (их называют "полилинкерами").

После встраивания чужеродной ДНК в вектор их ковалентное сшивание осуществляется ДНК-лигазой. Если же размер бреши в рекомбинированной молекуле превышает одну фосфодиэфирную связь, она застраивается in vitro с помощью ДНК-полимеразы или in vivo с помощью репарирующих систем клетки.


1.2.2. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ РНК


Получение рекомбинантных РНК обычно осуществляют методами ферментативного или химического лигирования РНК. Кроме того, недавно появилась принципиально но­вая возможность встраивания сегмента РНК в заданное положение других молекул РНК с помощью рибозимов.

Ковалентное сшивание отдельных сегментов РНК при получении рекомбинантных молекул, как правило, осуществляют с помощью Т4 РНК-лигазы. Т4 РНК-лигаза закоди­рована в геноме бактериофага Т4. Ее выделяют из клеток E.coli, зараженных этим фагом. Фермент сшивает друг с другом однотяжевые олиго- и полирибонуклеотиды. Для работы Т4 РНК-лигазы необходим источник энергии - аденозинтрифосфат. На рис. 2 приведена схема ферментативного лигирования двух коротких олигонуклеотидов. Как видно из этой схемы, акцептором в реакции лигирования служит пол­ностью дефосфорилированный, а донором - полностью фосфорилированный по концевым нуклеотидным остаткам олигонуклеотид. Это предотвращает возможность сшивания однотипных олигонуклео­тидов.

Эффективность ферментативного лигирования достаточно длинных полирибонуклеотидов сильно варьирует и ее трудно предсказать исходя только из нуклеотидной последовательности сегментов РНК. Наилучшие результаты получены в тех случаях, когда сшиваемые концы полирибонуклеотидов были пространственно сближены за счет комплементарного связывания соседних с ними участков РНК.

Недавно было установлено, что протяженные сегменты РНК (длиной в 200-300 остатков) могут быть с высоким выходом сшиты Т4 ДНК-лигазой. При этом "стыковка" сегментов осуществляется с по­мощью олигодезоксирибонуклеотида, комплементарного 3'-концу одного сегмента и 5'-концу другого.

Метод химиче­ского лигирования основан на активации концевой фосфатной группы одного из двух сшиваемых сегментов РНК водорастворимым карбодиимидом или

Рисунок 2. Схема сшивания двух олигорибонуклеотидов с помощью Т4 РНК-лигазы.


BrCN. В случае BrCN реакция про­текает очень быстро и не сопровождается модификацией нуклеотид­ных остатков, хотя под действием карбодиимидов фосфодиэфирная связь образуется с более высоким выходом. Для того, чтобы обеспечить сближенность сшиваемых концевых нуклеотидных остатков в фрагментах РНК, было предложено использовать олигодезоксирибонуклеотиды, комп­лементарные обоим фрагментам в месте их стыка.

Химическое лигирование РНК, как правило, проходит с существенно меньшим выходом, чем ферментативное. Однако оно позволяет получать рекомбинантные РНК с необычными типами межнуклеотидной связи (например, пирофосфатной) и необычными нуклеотидными остатками в месте стыка двух фрагментов.

Получение рекомбинантных РНК с помощью рибозимов основано на обратимости реакции самосплайсинга (при отсутствии гуанозина или гуаниловых нуклеотидов). Это предоставляет возможность для встраивания интронной РНК в заданный участок другого сегмента РНК (рис. 3). Фрагмент РНК, в который производится встраивание, должен содержать нуклеотидную последовательность, идентичную нуклеотидной последова­тельности 3'-концевого участка 5'-экзонного района 26S РНК и соот­ветственно комплементарную той нуклеотидной последовательности в интроне, которая отвечает за специфичность прямой реакции. Фраг­мент, в который производится встраивание, берется в избытке.

В настоящее время описанная здесь цепь реакций может быть реализована только для интронной РНК, получаемой из предшест­венника 26S РНК тетрахимены. Однако можно думать, что конструи­рование новых рибозимов может существенно расширить возможности этого подхода.


1.2.3. СТРАТЕГИЯ КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ


Векторные молекулы в обязательном порядке содержат маркерные гены, которые после переноса вектора в клетки-реципиенты сообщают им новые свойства. Это может быть устойчивость к антибиотику, которой до трансформации клетки не обладали, или образование фермента, синтез которого в клетках-реципиентах не происходил. Благодаря таким вновь приобретенным признакам клетки с векторными ДНК могут быть легко найдены в популяции исходных клеток. Одновременно могут быть отобраны те клетки, которые содержат векторы со встроенными в них чужеродными ДНК (рекомбинантные ДНК). Для этого встраивание чужеродной ДНК в вектор производится таким образом, чтобы один из маркерных признаков вектора нарушался. Так, например, если бактериальный вектор несет устойчивость к двум антибиотикам, то чужеродную ДНК встраивают в один

Рисунок 3. Схема прямого и обращенного процесса самосплайсинга.


из генов антибиотической устойчивости. И тогда бактерии с рекомбинантной ДНК, в отличие от бактерий с исходным вектором, могут расти в присутствии только одного из антибиотиков.

Другой весьма распространенный пример связан с наличием в векторной ДНК наряду с генами, сообщающими клетке устойчивость к антибиотикам, фрагмента лактозного оперона, обеспечивающего об­разование в клетках-реципиентах активного фермента -галактозидазы. Колонии клеток с таким признаком легко обнаруживаются при выращивании их на твердом агаре, содержащем в качестве субстрата -галактозидазы 5-бром-4-хлор-3-индолил--галактозид (X-gal), по­скольку его расщепление приводит к образованию бромхлориндола - красителя, окрашенного в голубой цвет. Если же в ген -галактозидазы этого вектора встроена чужеродная ДНК таким образом, что этот ген оказался нарушенным, то трансформированные им клетки будут обра­зовывать бесцветные колонии. Само же присутствие рекомбинантного вектора в клетках может быть зафиксировано по их устойчивости к антибиотику.

На следующем этапе среди популяции клеток с рекомбинантными векторами необходимо отобрать индивидуальные клоны, содержа­щие только интересующие нас гены или их фрагменты. Само собой разумеется, что это в принципе возможно только в том случае, если в исходные клетки проникло в среднем по одной молекуле рекомбинантной ДНК. Способ же отбора клонов в значительной степени зависит от природы клонируемого гена.

По-видимому, самым простым является случай, когда клониру­емый ген способен комплементировать ауксотрофную мутацию в штамме-реципиенте. В этом случае клетки высеваются на среду, ли­шенную вещества, необходимого для роста данного штамма, и только клетки, содержащие рекомбинантную ДНК с искомым геном, способны расти на этой среде. Из таких клонов получают гомогенную культуру клеток, которую используют для получения искомого сегмента ДНК, проделывая все операции в обратном порядке (то есть из клеток выделяют вектор, из него вычленяют необходимый фрагмент ДНК и так далее).

Гораздо чаще для отбора необходимых клонов приходится при­бегать к методу ДНК-ДНК- или ДНК-РНК-гибридизации. Для этого необходимо располагать "зондами" (индивидуальными молекула­ми ДНК или РНК или их фрагментами), комплементарными нуклеотидной последовательности клонируемого гена. Это могут быть специ­ально синтезированные олигодезоксирибонуклеотиды длиной в 15-20 остатков, последовательность которых выбрана на основании полно­стью или частично известной первичной структуры гена или закодиро­ванного в нем белка. Это могут быть кДНК, синтезированные на инди­видуальных РНК-копиях данного гена (как таковые или в виде отклонированных, то есть существенно умноженных в количестве фрагментов ДНК). Наконец, это могут быть сами индивидуальные РНК, закодированные в данном гене. Ясно, что во всех случаях "зонды" должны нести радиоактивную метку (обычно 32Р) с достаточно высокой удельной активностью.

Если же индивидуальный "зонд" недоступен, то применяют методы, которые из большого числа рекомбинантов (106) позволяют выбрать сравнительно небольшую группу (около 102), включающую рекомбинант с искомым геном. Эта группа подразделяется на подгруп­пы (например, на 10) по 10 рекомбинантов. Из каждой подгруппы выделяется ДНК, которую используют для синтеза мРНК и последу­ющей трансляции ее с целью обнаружения соответствующего продукта искомого гена.

Трансляция мРНК может быть осуществлена в бесклеточной системе. Однако в случае эукариотических генов мРНК часто перено­сят в ооциты лягушки (ксенопуса) с помощью техники микроинъек­ции, где она транслируется. Продукт трансляции обычно обнаружива­ют с помощью антител.

Далее в подгруппе, где обнаружен искомый ген, тем же методом исследуется каждый клон.

При наличии зонда с чашки Петри, на которой выращены колонии клеток, делается отпечаток (реплика) на нитроцеллюлозном фильтре. Клеткам дают вырасти на фильтре, затем их разрушают, подвергают ДНК щелочной денатурации и фильтр прогревают при 80°С, после чего ДНК необратимо с ним связывается. Фильтр отмыва­ют от примесей и обрабатывают радиоактивным "зондом" в условиях, оптимальных для ДНК-ДНК- или ДНК-РНК-гибридизации. После удаления избытка "зонда" методом ауторадиографии определяют поло­жение клеточного клона, содержащего участок ДНК с нуклеотидной последовательностью, комплементарной "зонду". Этот клон становит­ся затем источником клеток для получения искомого гена или его фрагмента.

Для селекции клонов, несущих необходимый ген, достаточно широко применяются и иммунологические методы. Принцип отбора на первых этапах тот же, что и при использовании ДНК- и РНК-зондов. Далее с колоний с рекомбинантными ДНК делается реплика с помощью полимерной пластинки, на которой закреплены антитела к продукту искомого гена. Положение клонов, вырабатывающих этот белок, опре­деляется также с помощью антител, но уже меченных радиоактивным йодом (125I).


1.2.4. РАЗНООБРАЗИЕ ВЕКТОРНЫХ МОЛЕКУЛ


Под понятием "вектор" понимается молекула нуклеиновой кислоты, способная после введения в клетку к автономному существованию за счет наличия в ней сигналов репликации и транскрипции.

Векторные молекулы должны обладать следующими свой­ствами:

1) способностью автономно реплицироваться в клстке-реципиенте, то есть быть самостоятельным репликоном;

2) содержать один или несколько маркерных генов, благодаря экспрессии которых у клетки-реципиента появляются новые призна­ки, позволяющие отличить трансформированные клетки от исходных;

3) содержать по одному или, самое большее, по два участка (сайта) для различных рестриктаз в разных районах (в том числе в составе маркерных генов), но не в области, ответственной за их репликацию.

В зависимости от целей эксперимента векторы можно условно разделить на две группы: 1) используемые для клонирования и амплификации нужного гена; 2) специализированные, применяемые для экспрессии встроенных чужеродных генов. Вторая группа векторов объединяет векторы, призванные обеспечить синтез белковых продуктов клонированных генов. Векторы для экспрессии содержат последовательности ДНК, которые необходимы для транскрипции клонированных копий генов и трансляции их мРНК в штаммах клеток.

В качестве прокариотических векторов используются плазмиды, бактериофаги; в качестве эукариотических векторов применяют вирусы животных и растений, векторы на основе 2 мкм дрожжей и митохондрий и ряд искусственно сконструированных векторов, способных реплицироваться как в бактериальных, так и в эукариотических клетках (челночные векторы).

Плазмиды - это внехромосомные генетические элементы про- и эукариот, которые автономно реплицируются в клетках. Большинство плазмидных векторов получено на основе природных плазмид ColE1, pMB1 и p15A.

Бактериальные плазмиды делят на два класса. Одни плазмиды (например, хорошо изученный фактор F, определяющий пол у E.coli) сами способны переходить из клетки в клетку, другие такой способно­стью не обладают. По ряду причин, и прежде всего для предотвращения неконтролируемого распространения потенциально опасного генети­ческого материала, подавляющее большинство бактериальных плазмидных векторов создано на базе плазмид второго класса. Многие при­родные плазмиды уже содержат гены, определяющие устойчивость клеток к антибиотикам (продукты этих генов - ферменты, модифици­рующие или расщепляющие антибиотические вещества). Кроме того, в эти плазмиды при конструировании векторов вводятся дополнитель­ные гены, определяющие устойчивость к другим антибиотикам.

На рис. 4 показан один из самых распространенных плазмидных векторов E.coli - pBR322. Он сконструирован на базе детально изученной плазмиды E.coli - колициногенного фактора ColE1 - и содер­жит ориджин репликации этой плазмиды. Особенность плазмиды ColE1 (и pBR322 соответственно) состоит в том, что в присутствии ингибитора синтеза белка антибиотика хлорамфеникола (опосредо­ванно ингибирующего репликацию хозяйской хромосомы) ее число в E.coli возрастает от 20-50 до 1000 молекул на клетку, что позволяет получать большие количества клонируемого гена. При конструирова­нии вектора pBR322 из исходных плазмид был делегирован целый ряд "лишних" сайтов для рестриктаз.

В настоящее время наряду с множеством удобных векторных систем для E.coli сконструированы плазмидные векторы для ряда дру­гих грамотрицательных бактерий (в том числе таких промышленно важных, как Pseudomonas, Rhizobium и Azotobacter), грамположительных бактерий (Bacillus), низших грибов (дрожжи) и растений.

Плазмидные векторы удобны для клонирования относительно небольших фрагментов (до 10 тыс. пар оснований) геномов небольших размеров. Если же требуется получить клонотеку (или библиотеку) генов высших растений и животных, общая длина генома которых достигает огромных размеров, то обычные плазмидные векторы для этих целей непригодны. Проблему создания библиотек генов для высших эукариот удалось решить с использованием в качестве клонирующих векторов производных бактериофага .

Среди фаговых векторов наиболее удобные системы были созда­ны на базе геномов бактериофагов и М13 E.coli. ДНК этих фагов содержит протяженные области, которые можно делегировать или за­менить на чужеродную ДНК, не затрагивая их способности реплицироваться в клетках E.coli. При конструировании семейства векторов на базе ДНК фага из нее сначала (путем делений коротких участков ДНК) были удалены многие сайты рестрикции из области, не сущест­венной для репликации ДНК, и оставлены такие сайты в области, предназначенной для встраивания чужеродной ДНК. В эту же область часто встраивают маркерные гены, позволяющие отличить рекомбинантную ДНК от исходного вектора. Такие векторы широко использу­ются для получения "библиотек генов". Раз­меры замещаемого фрагмента фаговой ДНК и соответственно встраи­ваемого участка чужеродной ДНК ограничены 15-17 тыс. нуклеотидных остатков, так как рекомбинантный фаго -


Рисунок 4. Детальная рестрикционная карта плазмиды pBR322.


вый геном, который на 10% больше или на 75% меньше генома дикого фага, уже не может быть упакован в фаговые частицы.

Таких ограничений теоретически не существует для векторов, сконструированных на базе нитчатого бактериофага М13. Описаны случаи, когда в геном этого фага была встроена чужеродная ДНК длиной около 40 тыс. нуклеотидных остатков. Известно, однако, что фаг М13 становится нестабильным, когда длина чужеродной ДНК пре­вышает 5 тыс. нуклеотидных остатков. Фактически же векторы, полу­ченные из ДНК фага М13, используются главным образом для секвенирования и мутагенеза генов, и размеры встраиваемых в них фрагментов намного меньше.

Эти векторы конструируются из реплекативной (двутяжевой) формы ДНК фага М13, в которую встроены "полилинкерные" участки (пример такой конструкции показан на рис. 5). В фаговую частицу ДНК включается в виде однотяжевой молекулы. Таким образом, этот вектор позволяет получать клонированный ген

Похожие рефераты: