Рекомбинантные вакцины (Генная инженерия)

или его фрагмент как в двутяжевой, так и в однотяжевой форме. Однотяжевые формы рекомбинантных ДНК широко используются в настоящее время при опреде­лении нуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгера и для олигодезоксинуклеотид-направленного мутагенеза генов.

Перенос чужеродных генов в клетки животных осуществляется с помощью векторов, полученных из ДНК ряда хорошо изученных вирусов животных - SV40, некоторых аденовирусов, вируса папиломы быка, вируса оспы и так далее. Конструирование этих векторов проводится по стандартной схеме: удаление "лишних" сайтов для рестриктаз, введе­ние маркерных генов в области ДНК, не существенные для ее репликации (например, гена тимидин-киназы (tk) из HSV (вируса герпеса)), введение регуляторных районов, повышающих уровень экспрессии ге­нов.

Удобными оказались так называемые "челночные векторы", спо­собные реплицироваться как в клетках животных, так и в клетках бактерий. Их получают, сшивая друг с другом большие сегменты век­торов животных и бактерий (например, SV40 и pBR322) так, чтобы районы, ответственные за репликацию ДНК, остались незатронутыми. Это позволяет проводить основные операции по конструированию век­тора в бактериальной клетке (что технически намного проще), а затем полученную рекомбинантную ДНК использовать для клонирования генов в животной клетке.

Рисунок 5. Рестрикционная карта вектора М13 mp8.

1.3. ВЫБОР СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ КЛОНИРОВАННОГО
ГЕНА, СПОСОБНОЙ ОБЕСПЕЧИТЬ МАКСИМАЛЬНЫЙ ВЫХОД И
ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ ПОЛНОЦЕННОСТЬ ПРОДУКТА

Полученные рекомбинантные молекулы переносятся в определенные группы клеток, которые должны обеспечить экспрессию этих генов, то есть синтез соответствующих белков в количествах, экономически рентабельных по сравнению с обычной технологией их производства.

Обычно для данной цели используют бактериальные или дрожжевые культуры клеток, а также системы экспрессии на основе эукариотических клеток.

Из бактериальных клеток наиболее изученной в молекулярно-генетическом отношении является грамотрицательная бактерия Escherichia coli, поэтому для нее можно с наибольшей определенностью планировать генноинженерные конструкции. Однако E. coli слабо освоена промышленностью. Кроме того, она относится к условно-патогенным для человека микроорганизмам, что может создать трудности при получении на ее основе фармацевтических препаратов.

Отмеченные недостатки E. coli легко преодолеваются при конструировании методами генной инженерии штаммов-продуцентов на основе клеток Bacillus subtilis. Данная почвенная бактерия безопасна для человека и животных и прекрасно освоена микробиологической промышленностью. Бактерия B. subtilis по степени изученности следует за E. coli. Важное отличие ее от E. coli - способность эффективно секретировать во внешнюю среду целый ряд белков, поэтому особенно интересны работы по созданию штаммов-продуцентов B. subtilis, секретирующих чужеродные белки из клеток. Однако данная бактерия имеет свои недостатки: рекомбинантные плазмиды в B. subtilis характеризуются нестабильностью, выражающейся в перестройках и делециях ДНК; бациллы секретируют в культуральную среду большое количество протеаз, что существенно усложняет вопрос максимализации генноинженерного получения целевого белка на основе бацилл-продуцентов.

Среди эукариотических микроорганизмов наиболее изученным является низший эукариот Saccharomyces cerevisiae. Одно из преимуществ S. cerevisiae как экспериментальной системы - простота и надежность ее генетического анализа. В клетках дрожжей имеется ферментативная система гликозилирования белков, которая обеспечивает возможность синтеза в них полноценных белков высших эукариот. Аналогичных систем процессинга белков в бактериальных клетках нет. Многие штаммы дрожжей освоены микробиологической промышленностью. Доказана их безвредность для человека и животных. Именно на S. cerevisiae создан первый штамм-продуцент поверхностного антигена вируса гепатита Б, позволивший получить и испытать вакцину против данного вирусного заболевания человека.

С появлением генной инженерии внимание многих исследователей привлекла система культивируемых клеток животных. Особый интерес к культурам клеток животных стал проявляться после обнаружения того, что часть эукариотических генов раздроблена и лишь в системе клеток высших эукариот можно достичь правильной экспрессии таких генов. Кроме того, многие белки животных и их вирусов синтезируются первоначально в виде более высокомолекулярных предшественников, которые в результате специфического протеолитического процессинга переходят в так называемую зрелую форму. Такой процессинг данных белков, по-видимому, можно ожидать лишь в системе клеток животных. Все это убедительно доказывает важность разработки экспрессирующей системы на основе клеток животных.

Для обеспечения наиболее эффективной экспрессии клонированных генов в векторные молекулы встраивают определенные фрагменты ДНК, позволяющие увеличить выход чужеродного белка. Так, для достижения более высокого уровня экспрессии гена HBsAg в клетках E. coli были использованы различные по силе промоторы (промоторы генов cat, kan, bla, trp и тандемно расположенных промоторов генов kan и trp). Уровни синтеза последовательностей HВsAg (нативного и в составе химерных белков) составляли в зависимости от используемых конструкций векторов от 100 до 100000 молекул на клетку.

1.4. СОЗДАНИЕ ДОСТАТОЧНО УДОБНЫХ И ПО ВОЗМОЖНОСТИ

УНИВЕРСАЛЬНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ЦЕЛЕВОЙ ДОСТАВКИ ГЕНОВ В

КЛЕТКИ И ТКАНИ ОРГАНИЗМА

Важным моментом при конструировании ДНК-вакцин является проблема целенаправленной доставки генов в необходимые клетки и защиты вводимых ДНК от действия нуклеаз крови. В результате экспериментальной работы были созданы разнообразные конструкции, позволяющие доставлять целевые гены в клетки-мишени.

Одной из подобных конструкций является модель молекулярного вектора для доставки генов в такие клетки, как лимфоциты и кераноциты. В качестве модельного был использован ген, кодирующий гибридный белок: фактор некроза опухолей-альфа - интерферон-гамма. В центре вектора находится интактная плазмидная ДНК, содержащая доставляемый ген, а на поверхности располагаются антитела к клеткам-мишеням. Конъюгат полиглюкина со спермидином и антителами применяется для связи компонентов (положительно заряженный спермидин обеспечивает связывание конъюгата с плазмидной ДНК). Описанный молекулярный вектор позволяет целенаправленно доставлять гены в клетки-мишени, сводя до минимума их попадание в другие виды клеток, защищать доставляемые гены от нуклеаз крови и использовать положительно заряженный комплекс спермидин-полиглюкин в качестве стимулятора проникновения ДНК в клетки.

В настоящее время также создана векторная модель для доставки в клетки костного мозга гена, кодирующего гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (чГ-КСФ). Данный белок относится к семейству гемопоэтических факторов роста и является одним из физиологических регуляторов, специфически и высокоэффективно стимулирующих пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических предшественников нейтрофилов. чГ-КСФ увеличивает продолжительность жизни клеток костного мозга, усиливает функциональную активность зрелых нейтрофилов. Созданный вектор представляет собой многослойную конструкцию. "Центральным ядром" конструкции является плазмида pGGF8, содержащая ген чГ-КСФ. Ее окружает полисахаридная оболочка, которая состоит из полиглюкина и спермидина. Внешний белковый слой содержит смесь сывороточного альбумина и белка доставки - трансферина. Эффективность описанной векторной модели была доказана опытным путем.

Итак, при конструировании рекомбинантных противовирусных вакцин немаловажное значение имеет создание специального вектора-носителя, обеспечивающего адресную доставку генов и их защиту от действия нуклеаз крови.

2. ВАКЦИНА ПРОТИВ ЛЕЙКЕМИИ КОШЕК,

ИЗГОТОВЛЕННАЯ С ПОМОЩЬЮ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Возбудителем лейкемии кошек является ретровирус типа С. Вирус лейкемии кошек (FeLV) имеет в качестве генетического материала молекулу РНК. Заболеваемость и смертность среди домашних кошек в Швейцарии довольно высока. Вакцина против FeLV, изготовленная традиционным путем, была разработана несколько лет тому назад и находится в продаже в Швейцарии. Высокая цена современных вакцин и отсутствие уверенности в отношении длительности эффекта и надежности вакцины вызвали необходимость создания вакцины с помощью генной инженерии.

При конструировании рекомбинантной вакцины оболочечный протеин вируса (env-ген) клонировался в пивных дрожжах (Saccharomyces cerevisiae). Env-ген вначале лигировался с промотором дрожжей (пируваткиназный промотор), а затем клонировался в так называемом "Shuttle"-векторе. Вектор "Shuttle" (челночный вектор) может размножаться как в бактерии E. coli, так и в пивных дрожжах S. cerevisiae.Он содержит с одной стороны репликационные оригины как для дрожжей, так и для E. coli, а с другой стороны селекционный маркер для дрожжей (leu2 ген) и для E.coli (резистентность к ампицилину). Из литра дрожжевой культуры выделяют множество миллиграмм env-протеина и затем тестируют в опыте по вакцинации. Результат вселяет надежду: 10 кошек были иммунизированы env-протеином, причем 4 дали ответ антителами. Через 2 недели провели заражение FeLV. Теперь все животные давали ответ антителами.

Таким образом, полученная вакцина оказалась эффективным средством для борьбы с данным заболеванием.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Грен Э. Я., Пумпен П. П. Рекомбинантные вирусные капсиды - новое поколение иммуногенных белков и вакцин // Журнал ВХО. - 1988. - т. II, №5. - с. 531-536.

2. Дмитриев Б. А. Проблемы и перспективы создания синтетических вакцин // Иммунология. - 1986. - №1. - с. 24-29.

3. Лебедев Л. Р., Сизов А. А., Масычева В. И., Карпенко Л. И., Рязанкин И. А. Молекулярный вектор для доставки генов в клетки-мишени // Биотехнология. - 2001. - №1. - с. 3-12.

4. Мертвецов Н. П., Беклемишев А. Б., Савич И. М. Современные подходы к конструированию молекулярных вакцин. - Новосибирск: Наука, 1987, 210 с.

5. Сизов А. А., Лебедев Л. Р., Масычева В. И., Кашперова Т. А., Одегов А. М. Разработка вирус-подобной конструкции для рецептор-опосредованного транспорта гена чГ-КСФ в клетки костного мозга in vivo // Биотехнология. - 2001. - №1. - с. 13-18.

6. Шабарова З. А., Богданов А. А., Золотухин А. С. Химические основы генетической инженерии. - М.: Изд-во МГУ, 1994, 224 с.

7. Щелкунов С. Н. Клонирование генов. - Новосибирск: Наука, 1986, 232 с.

8. Юров Г. К., Народицкий Б. С., Юров К. П. Конструирование и использование ДНК-вакцин // Ветеринария. - 1998. - №12. - с. 25-27.

9. Hubscher U. Генная инженерия и ветеринария. Вакцины, изготовленные с помощью генной инженерии, и анализ высоковариабельных участков ДНК. -Schweiz. Arch. Tierheilk., 1987, 129, №11, 553-564.