Cигнальные пути клеток в онтогенезе животных

Механизмы возникновения огромного разнообразия клеточных типов и морфологических форм в процессе развития высших организмов всегда интересовали биологов разных специальностей. В ранних опытах прошедшего тысячелетия по пересадке тканей от одних эмбрионов другим у многоклеточных организмов было показано, что ведущую роль в регуляции развития животных играют межклеточные взаимодействия. Было сделано предположение о том, что пути развития клеток регулируются секретируемыми сигнальными молекулами, и взаимодействие эмбриональных закладок через детерминацию и дифференцировку приводит к формообразовательному эффекту. В последние два десятилетия генетики и биохимики значительно продвинулись в изучении процессов распространения информации в онтогенезе (Гилберт, 1995; Корочкин, 1999; Jonhston, Gallant, 2002).

Роль сигнальных систем в развитии организмов и их свойства

Хорошо показано, что в развивающихся эмбрионах различных представителей позвоночных и беспозвоночных животных межклеточные взаимодействия координируются набором сигнальных путей. Большую часть межклеточных сигналов передает небольшое число в разной степени изученных основных сигнальных каскадов генов, связанных с активностью определенных сигнальных молекул (лигандов, рецепторов и др.) и получивших соответствующие обозначения (Mumm, Kopan, 2000; Тарчевский, 2002; Серов, 2003; Pires-daSilva, 2003). Среди них сигнальные пути Hh (Hedgehog) (Ingham, McMahon, 2001); Wnt (wingless) (Cadigan, Nusse, 1997); Notch (Mumm, Kopan, 2000); ростовых факторов: TGF-? (Massague, Chen, 2000), EGFR (Freeman, 2002), RTK (Шемарова, 2003), JAK/STAT (Luo, Dearolf, 2001); ядерных рецепторов гормонов (Glass, Rosenfeld, 2002). Прототипы разных многокомпонентных сигнальных систем с высокой степенью гомологии молекулярных механизмов передачи сигнала можно найти уже у прокариот и низших эукариот. При переходе к многоклеточным эукариотам сигнальные белки претерпевают структурные изменения, образуют белковые комплексы; повышается эффективность сигнальной трансдукции (Шемарова, 2003; Шпаков и др., 2003).

Несмотря на разные конечные результаты детерминации и дифференцировки в онтогенезе беспозвоночных и позвоночных, наблюдается консерватизм в развертывании одного и того же сигнального каскада у разных живых организмов. В геномах разных видов гены, контролирующие развитие, эволюционно консервативны и имеют сходные функции. Например, сигнальная система Hh, в которой секретируемыми лигандами являются белки семейства Hedgehog, обнаружена у человека, мыши, курицы, лягушки, рыбы, морского ежа, пиявки и насекомых (Ingham, McMahon, 2001). Wnt-путь также широко распространен среди животных. Белки Wnt составляют одно из наибольших семейств сигнальных молекул у человека, мыши, лягушки, Caenorhabditis elegans, дрозофилы (Cadigan, Nusse, 1997; Baonza, Freeman, 2002).

Наряду с жестким консерватизмом генные сигнальные системы обладают высокой степенью гибкости в ответах на межклеточные сигналы. Каждая из них неоднократно включается в разных тканях в течение развития индивидуумов, регулируя пространственное и временное разделение экспрессии генов, определяющих различные судьбы клеток. Так, белки семейства Hh считаются участниками клеточной детерминации и дифференцировки, деления клеток, посредниками многих основных процессов эмбрионального роста и развития. У позвоночных развитие только небольшого числа морфологических отделов тела не подвержено влиянию Hh-сигнала (Ingham, McMahon, 2001). У дрозофилы Hh-белки экспрессируются в клетках заднего отдела каждого имагинального диска. Им принадлежит центральная роль в  эмбриональном развитии крыла, глаза, конечностей, гонад, брюшка, кишки и трахеи (Mohler, Vani, 1992; Zhang, Kalderon, 2000; Glazer, Shilo, 2001). В то же время члены семейства белков Wnt участвуют в разных процессах развития. У дрозофилы они необходимы для организации центральной нервной системы, детерминации области крылового и глазного примордиев, ограничения размера глазной области в диске, инициации границы между глазными и прилежащими структурами головы, специализации клеток глаза и кутикулы головы (Ng et al., 1996).

Передача сигналов может идти по короткой или длинной цепи через активацию другого каскада, быть прямой или непрямой. Примером короткого каскада может являться STAT-путь. Здесь после агрегации рецепторов факторов роста ассоциированные с ними JAK-протеинкиназы активируются путем трансфосфорилирования. Активированные JAK-киназы прямо активируют транскрипционные факторы, STAT-белки, локализованные в цитоплазме (Шемарова, 2003). В эмбриональной эктодерме дрозофилы сигнал Hh тоже передается на короткое расстояние и ограничивается воздействием на близлежащие клетки. На границе каждого сегмента эмбриона белок Нh секретируется узкой полосой клеток и выступает в роли морфогена, детерминирующего позиционную информацию в сегментах. В одной части соседних клеток поддерживается транскрипция гена wingless (wg), в другой – подавляется экспрессия гена Serrate (Ser) (Mohler, Vani, 1992; Hatini, DiNardo, 2001).

Примером разветвленного сложного пути может являться Ras/MAP-киназный каскад. Активаторами каскада являются способные к автофосфорилированию регуляторные киназы. Полифункциональный фермент МАР-киназа фосфорилирует и активирует цитоплазматические, мембранные и ядерные белки, превращая последние в факторы транскрипции (Шемарова, 2003). В имагинальном диске крыла дрозофилы позиционная детерминация возникает в результате длинноразмерного эффекта лиганда Hh. Секретируемый клетками заднего компартмента Hh распространяется через несколько клеточных рядов в передние компартменты, формируя градиент концентраций. В этом контексте Hh активирует разные гены-мишени по типу дозовой зависимости не только в близлежащих клетках. Клетки в зависимости от положения в морфогенетическом градиенте и интенсивности сигналов по-разному отвечают на присутствие Hh: они, включая разные программы дифференцировки, активируют или репрессируют разные комбинации генов и формируют разные типы клеток (Vervoort, 2000). У лягушки, рыбы, курицы и мыши белок Shh, родственный Hh, также производит действие на значительной дистанции от места его секреции. Формируя градиент концентрации в вентральной части нейтральной трубки или зачатках конечностей сквозь десятки клеточных диаметров, Shh активирует или репрессирует разные группы регуляторов транскрипции, определяет направление дифференцировки клеток или образование передне-задней полярности (Zeng et al., 2001). В развивающемся эмбрионе белки Wg также могут действовать в пределах короткой и длинной дистанции, распространяясь в разных тканях на расстояние нескольких диаметров клеток от места синтеза. Паттерн экспрессии генов в клетках, отвечающих на сигнал, зависит от концентрации Wg (Neumann, Cohen, 1997).

Результаты сигнальной индукции существенно зависят от взаимодействия между каскадами. Разные сигнальные системы связываются между собой через боковые передающие цепочки, возникающие на многих ступенях трансдукции, активируя друг друга промежуточными продуктами. На сегодняшний день известно немало фактов взаимного влияния сигнальных путей. Так, у дрозофилы во время развития крыла взаимодействуют Hh-, Dpp- и EGFR-каскады (Crozatier et al., 2002), в специализации клеток ног участвуют RAS/MAPK- и EGFR-пути (Alamo et al., 2002), с развитием почечных канальцев связаны сигнальные системы EGFR и Wg (Sudarsan et al., 2002). Пока нет ясного понимания конкретных молекулярных механизмов этих взаимодействий. Однако возможность возникновения сети сигнальных путей может определяться некоторыми свойствами передающих сигналы белков. Так, одни и те же лиганды способны связываться с разными рецепторами и активировать альтернативные пути развития клеток. Такие неоднозначные действия могут быть следствием альтернативного сплайсинга транскриптов соответствующих генов и образования множества независимых изоформ лигандов и рецепторов с измененными внеклеточными доменами (Missler, Sudhof, 1998). В свою очередь, один и тот же рецептор в разных тканях может активировать разные внутриклеточные передатчики. В регуляции экспрессии генов-мишеней могут одновременно участвовать несколько сигнальных путей, образуя общий сигнальный белок или действуя совместно на разные модули энхансеров генов, причем одинаковые сигналы могут вызывать разные паттерны экспрессии. Активная конформация транскрипционных факторов может формироваться одновременно протеинкиназами из разных сигнальных систем. Наконец, специфичность ответа может зависеть от компартментализации сигнала на клеточной поверхности (Тарчевский, 2000; Millor, Altaba, 2002; Pires-daSilva, 2003).

Структурно-функциональные элементы сигнального пути

Общим в деятельности сигнальных каскадов, различающихся наборами генов и биохимическими механизмами, является передача сигнала от клеточной поверхности в ядро, активация соответствующих генов-мишеней через регуляцию сигнал-зависимых транскрипционных факторов. Функции сигналов выполняют молекулы лигандов – гормоны, факторы роста или морфогены, секретируемые посылающими клетками в межклеточное пространство. Специфичность проведения сигнала зависит от компетентности воспринимающих клеток, от их способности распознавать индукцию определенными рецепторами. Белковые молекулы разных рецепторов состоят из трех основных доменов: внешнего N-концевого, трансмембранного и цитоплазматического С-концевого. Рецепторы пронизывают мембраны воспринимающих клеток один или несколько раз, выступая с обеих сторон над ее поверхностью. Обычно активация сигнального пути начинается с прямого физического контакта внеклеточного домена лиганда, поступившего в межклеточный матрикс после протеолизиса, с внешним участком трансмембранного рецептора на поверхности клетки (Гилберт, 1995; Pires-daSilva, 2003). Известно, что у дрозофилы сигнальными свойствами Hh и способностью удерживаться мембраной обладает

N-концевой модифицированный холестеролом фрагмент Hh-Np белка. Рецептор для этой системы Patched (Ptc), принадлежащий к семье ростовых интегрированных с мембраной белков и имеющий стерол-чувствительный домен, кодируется геном ptc (Ingham, 2001). Рецепторы для секретируемой формы лигандов Wnt, трансмембранные белки Frizzled (Fz) у дрозофилы, C. elegans, шпорцевой лягушки, мыши и человека кодируют гены fz. Белки этого семейства с характерными богатыми цистеином внеклеточными и трансмембранными доменами консервативны в большей части своей последовательности (Cadigan, Nusse, 1997).

Взаимодействие с лигандом меняет конформацию рецепторного белка, что делает его уязвимым для многих протеолитических ферментов. Ферменты расщепляют молекулу рецептора и внутренний домен освобождается от клеточной мембраны. Активизированная внутриклеточная часть рецептора поступает в цитоплазму и включается в модификацию цитоплазматических переносчиков сигнала. Они в свою очередь активируют транскрипционные факторы, регулирующие изменение экспрессии генов-мишеней. Модификация конформации и активности рецептора и других молекул, передающих сигнал на разных ступенях каскадов, обычно происходит путем протеолизиса, димеризации, олигомеризации, фосфорилирования, дефосфорилирования или других реакций (Тарчевский, 2002; Kheradmand, Werb, 2002). Фосфорилирование по остаткам серина, треонина и тирозина – наиболее частая посттрансляционная модификация сигнальных белков. У млекопитающих изменение тирозинкиназной активности белков сигнальных каскадов факторов роста (фибробластов – FGF, тромбоцитов – PDGF, эпидермального фактора роста – EGF) играет важную роль в индукции дифференцировки, пролиферации, роста разных типов клеток. Фосфорилирование катализируется ретровирусными протеинтирозинкиназами или тирозинкиназами, часто ассоциированными с С-концевыми цитоплазматическими доменами рецепторов факторов роста (RTK). Активированная RTK фосфорилирует другие участники проведения сигнала, в том числе и транскрипционные факторы STAT и ГТФазы Ras, так называемые G-белки (Шемарова, 2003).

Рассмотрим морфогенетические свойства, генетическую структуру, ход передачи сигнала на конкретном примере Notch-передающего каскада у дрозофилы.

Участие Notch в онтогенезе дрозофилы

Механизмы передачи сигнала каскадом Notch в животном мире универсальны, ему присущи все характерные свойства сигнальных систем. Белок Notch, который служит рецептором для Notch-сигнального пути, выделен как у беспозвоночных, так и позвоночных: дрозофилы, нематоды, лягушки, рыб, грызунов, человека. Путь Notch через латеральное ингибирование или индукцию участвует фактически во всех клеточных контактах у животных и наиболее изучен у Drosophila melanogaster. Подобно другим передающим каскадам, он определяет судьбу дифференцирующихся клеток в разное время и в разных зачатках развивающегося организма (Artavanis-Tsakonas et al., 1995; Portin, 2002; Вайсман и др., 2002). В эмбрионах дрозофилы в ходе морфогенеза центральной нервной системы (ЦНС) и сенсорных щетинок сигнальный каскад Notch служит для разделения нейрального и эпидермального зачатков в нейродерме, передавая сигналы от презумптивных нервных клеток, запрещающие соседним клеткам дифференцировку в нервную ткань. У Notch-мутантов с потерей функции гена меняется структура и клеточный состав сенсорных щетинок, а также за счет уменьшения числа эпидермальных клеток увеличивается число клеток-предшественниц нервной ткани, что приводит к эмбриональной летальности (Hartenstein et al., 1996; Корочкин, Михайлов, 2000).

Деятельность пути Notch связана с локальными взаимодействиями между стереотипными клетками в процессе формирования глаза. Уменьшение активности Notch приводит к выбору дифференцирующимися клетками сетчатки не свойственного им пути развития и формированию неполноценных фоторецепторов, изменению числа и расположения составляющих элементов глаза и щетинок, гибели клеток (Cagan, Ready, 1989; Baonza, Freeman, 2001). Показано участие сигнального пути гена Notch во взаимодействиях между соседствующими клетками из дорзального и вентрального отделов крылового имагинального диска на стадии пролиферации, в формировании края крыла и ограничении числа клеток, дифференцирующихся в жилки крыла. Мутации с полной потерей функции гена приводят к полной потере ткани крыла (Diaz-Benjumea, Cohen, 1993). Notch-путь контролирует у дрозофилы развитие полярных клеток в оогенезе. Редукция функции гена у мутантов Notch вызывает нарушения, вероятно, связанные с неправильной спецификацией фолликулярных клеток и изменением их взаимодействия с развивающимся ооцитом, изменением локализации белков в ооците. Это вызывает морфологические отклонения в гермариуме и вителлариуме и снижение скорости кладки яиц (Ruohola et al., 1991; Xu et al., 1992). У дрозофилы путь Notch контролирует также развитие сегментированных придатков, ног и антенн. Локальная экспрессия Notch необходима для роста ног и образования связок между сегментами, определения границы компартментов ног. Нарушение миогенеза с увеличением числа клеток-предшественниц и кластеров миобластов у мутантов Notch свидетельствует об участии этого пути в миогенезе (Rauskolb, 2001).

Гены Notch-сигнального пути у дрозофилы

В локальных межклеточных взаимодействиях между незрелыми клетками Notch-путь контролирует ответ на специфические сигналы во время развития и определяет судьбу широкого спектра клеток в онтогенезе. На основании данных о генетических и молекулярных взаимодействиях ряд генов у Drosophila melanogaster с определенностью относят к кодирующим элементам Notch-сигнального пути: Delta (Dl,  3-66.2; 92А1-2), Serrate (Ser, 3-92.5; 97F1-F2), Notch (N, 1-3.0; 3C7), kuzbanian (kuz; 34C4-5) и Presenilin (PS; 77C1-7) – кодирующие, связанные с мембраной белки; Hairless (H, 3-69.5; 92E14-92E14), Supressor of Hairless (Su(H), 2-50.5; 35B10) и Enhancer of split (E(spl), 3-89.1; 96F11-14) – контролирующие ядерные белки (Lindsley, Zimm, 1992).

Получено немало данных о плейотропном действии, сходстве фенотипов или взаимном влиянии мутаций генов сигнального пути и нормальных и мутантных аллелей Notch. Так, ген Delta играет важную роль в процессе развития дрозофилы. У гетерозигот Drosophila melanogaster по мутации Dl возникают дефекты крыла, нарушается порядок расположения фасеток глаза, формируются дополнительные щетинки на голове, тораксе и брюшке. Гомозиготные по Dl эмбрионы гибнут в результате гиперплазии нервной системы, а в гомозиготных клонах крылового диска нарушается дифференцировка клеток. Экспрессия Dl зависит от дозы нормального аллеля Notch. Одно только увеличение дозы Notch у нормальных мух приводит к возникновению Dl-фенотипа. В свою очередь редукция активности Dl у температурочувствительных мутантов на поздней второй и ранней третьей личиночной стадиях дает фенотип крыльев, подобный фенотипу гетерозигот по нуль-аллелям N. Известны и другие примеры генетических взаимодействий между Notch и Delta (Doherty et al., 1996; Lawrence et al., 2000; Губенко, 2001).

Плейотропное проявление характерно для мутаций другого гена Notch-каскада, Serrate. В гомозиготном состоянии мутанты Ser обычно гибнут на личиночной стадии из-за серьезных морфологических дефектов ЦНС, не развитых дыхалец, резко уменьшенного в размере крылового примордия. У редко выживающих взрослых гомозиготных мух видны рудиментарные крылья и полностью редуцированные гальтеры, уменьшенные и грубые за счет снижения числа и порядка расположения омматидиев глаза. Возникновение Ser-гомозиготных клонов в имагинальном крыловом диске сопровождается появлением протяженных вырезок в разных районах крыла у взрослых мух (Speicher et al., 1994). Serrate и Notch оказывают влияние на фенотипическое проявление друг друга. Например, одна доза доминантной мутации SerD вызывает у взрослых мух вырезки крыльев, напоминающие фенотип notchoid (nd), рецессивного аллеля локуса Notch. У самцов генотипа nd/Y; SerD/+ мутантный фенотип усиливается, исчезают передний и задний края крыла и ткань дистальной части пластины крыла. Дополнительная копия аллеля дикого типа Notch нормализует фенотип у мух SerD (Fleming et al., 1990).

Еще один участник Notch-пути с плейотропным действием, локус Hairless, задействован в развитии центральной и периферической нервной системы, крыльев и глаз. Уменьшение функции Hairless вызывает формирование дефектных макрохет или полную их редукцию, укорочение жилок крыла, отсутствие щетинок на крыльях и между омматидиями глаз. Повышенная экспрессия Hairless у трансгенных мух вызывает образование дополнительных щетинок. Отмечено фенотипическое сходство между Hairless-мутациями с потерей функции и Notch-мутациями с повышенной функцией (Lyman et al.,