Состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозе
Для изучения корреляции у крупного рогатого скота между пассивно приобретенными антителами и инфекционными заболеваниями были проведены многочисленные исследования, применяя метод количественного определения иммуноглобулинов [A. D. Me Ewan, E. W. Fisher, I. E. Selman, 1970; J. W. Boyd, 1972; W. J. Penhale, E. F. Logan, I. E. Selman, E. W Fisher, 1973; E. F. Logan, A. Stenhouse, D. J. Ormorod and W. J. Penhale, 1974; G. H. Stott and E. J. Reinhard, 1978; G. G. B. Klaus, A. Bennett and E. W. Jones, 1979; G. H. Stott, D. В. Marx, В. E. Menefel, and G. T. Nightengale, 1979; N. H. Teng, H. S. Kaplan, J. M. Herbert, 1985].
Наиболее широко применяются метод прямой радиальной иммунодиффузии [N. E. Pfeiffer, T. C. McGuire, 1977; В. М. Чекишев, 1977; N. E. Pfeiffer, T. C. McGuire, R. E. Bendel and J. M Weikel, 1977; А. А. Тихомиров, 1997] и цинк-сульфатный тест помутнения [A. D. Mс Ewan, E. W. Fisher, I. E. Selman and W. J. Penhale, 1970; Н. С. Жосан, 1989].
Наиболее точный и простой метод для тестирования уровня иммуноглобулинов, применяемый на ферме или в научной лаборатории является натрий-сульфитный преципитационный тест. Натрий сульфит в соответствующей концентрации (14, 16, 18 %) вызывает преципитацию иммуноглобулинов, подобно тому как и цинк-сульфатный тест. Значение помутнения, вызываемого взаимодействием натрия сульфита и иммуноглобулинов пропорционально степени защиты телят [N. E. Pfeiffer, T. C. McGuire, 1977; N. E. Pfeiffer, T. C. McGuire, R. E. Bendel and J. M Weikel, 1977; T.C. McGuire, D.S. Adams, 1982; Ю. Н. Федоров, 1988].
Для выявления гипогаммаглобулинемии у неонатальных телят применяют также быстрый скрининг тест. Тест основан на коагуляции иммуноглобулинов глутаральдегидом в 10 % концентрации. Иммуноглобулиновая концентрация у исследуемых телят, данным методом, была классифицирована как высокая 6 мг/мл, промежуточная 4,1-6 мг/мл и низкая 4 мг/мл [B. Tennant, B.H. Baldwin, 1979].
1.3. Неспецифическая иммунологическая реактивность новорожденных телят
Результаты многолетних исследований состояния неспецифической иммунологической реактивности организма сельскохозяйственных животных свидетельствует о том, что защитные силы их являются динамичным показателем и определяются как генетическими особенностями организма, так и воздействием различных факторов окружающей среды. Неблагоприятное воздействие окружающей среды приводит к ослаблению устойчивости организма и, как правило, к возникновению и распространению различных заболеваний, в том числе и инфекционных. Организм животных в процессе внутриутробного развития продуцирует клетки, осуществляющие фагоцитоз и молекулы с выраженным противомикробным действием — лизоцим, комплемент, пропердин, иммунные глобулины и другие факторы естественной резистентности. С возрастом животных они динамически изменяются [С. J. Howard, A. A. Glynn, 1971; В. В. Никольский, В. П. Литвин, 1974; П. А. Емельяненко, 1979; В. Т. Сидоров, 1984; B. C. Шипилов, В. К. Копытин, 1984; R.M. Miller, A.J. Guidry, M.J. Poape, 1988; G. Mulcahy, P.J. Gunn, 1988; С. И. Плященко, 1991].
Иммунологическая реактивность у новорожденных телят формируется постепенно и достигает полноценной выраженности только на определенном уровне их индивидуального физиологического развития [B. C. Бузлама, С. М. Сулейманов, В. Н. Долгополов, Н. Н. Коновалов, М. Н. Рецкий, И. С. Толкачев, Т. И. Агеева, 1978].
В качестве критериев степени реактивности животного организма используют [В. В. Никольский, В. П. Литвин, 1974]: динамику накопления антител, колебание бактерицидной активности крови, опсоно-фагоцитарную реакцию, специальную внутрикожную пробу и картину крови. В течение первых 10-15 дней жизни у телят более выражена клеточная защитная функция организма, характеризующаяся активным фагоцитозом микроорганизмов. Так, опсоно-фагоцитарный показатель по отношению к кишечной палочке в первые 10-15 дней жизни равнялся 8, в 30-40 дней — 3,7 а в 60-70 дней — 1,4. Сходные результаты получены при изучении гуморальных защитных факторов организма. Фагоцитарная способность лейкоцитов в крови играет большую роль в противомикробной защите новорожденного теленка. По данным исследователей, фагоцитарная активность гранулоцитов крови новорожденных телят до выпойки молозива летом (июнь-июль) достигает 98-100 % (у матерей 90-95 %). Фагоцитарное число (8-16) несколько ниже, чем в крови коров-матерей (16-19). Активность лизоцима по лизису тест-микроба в агаровом геле определяли в сыворотке крови телят и молозиве коров-матерей. Количество лизоцима в 5 первых порциях молозива равно 13±0,26 мкг/мл, в сыворотке крови новорожденных телят до выпойки молозива — 12±0,69, на 10-й день — 13,4±0,61 и в 3 месяца — 12,5±0,017. Таким образом, авторы не установили различий в содержании лизоцима в сыворотке крови телят в разных возрастных периодах [С. Н. Преображенский, Н. И. Блинов, Н. В. Ершова, Г. В. Вышинский, 1974].
В университете штата Оклахома, национальной лаборатории по изучению болезней животных в США и Гуэлфском университете Канада [O. Barta, V. Barta, 1972] на плодах и новорожденных телятах определяли бактерицидную активность крови. Двукратно разведенную сыворотку крови, в объеме 0,2 мл смешивали с равным объемом взвеси культуры содержащей 104 мл клеток бактерий кишечной палочки. Смесь выдерживали час при температуре 37° С и 0,1 мл ее высевали на плотную среду. Посевы выдерживали 16-18 ч при 37° С, подсчитывали число колоний и определяли дозу сыворотки, задерживающую рост 50 % бактерий. Антитела определяли по реакции агглютинации и пассивной гемагглютинации. Бактерицидная активность сыворотки крови составляла соответственно (в 1 мл сыворотки, задерживающей рост 50 %) бактерий у новорожденных телят 0,0036 и 0,0068.
При изучении иммунологической неспецифической реактивности организма новорожденных телят, [П. А. Емельяненко, 1979] определял фагоцитарную активность нейтрофилов и моноцитов крови, а также содержание в ее сыворотке лизоцима, комплемента и пропердина. Он установил, что у погибших телят от острых желудочно-кишечных болезней достоверно снижался процент фагоцитоза нейтрофилов, незначительно снижался уровень комплемента, пропердина и лизоцима.
При иммунобиологическом исследовании крови и сыворотки крови определяют [Д. Келмен, 1967; В. Я. Мозгис, 1982]:
фагоцитоз лейкоцитов по отношению к золотистому стафилококку 209р;
бактерицидную активность (БАСК);
активность бета-лизинов (БЛСК) сыворотки крови методом фотонефелометрии. Сущность метода заключается в том, что микробы (в данном случае, изолированный от телят штамм кишечной палочки — штамм 83) в течение 5 и 14 ч соответственно подвергаются воздействию исследуемой сыворотки. Чем слабее бактерицидная и бетализиновая активность сыворотки, тем интенсивнее размножаются микробы и тем более мутной становится взвесь;
лизоцимную активность сыворотки крови.
При круглогодовом стойловом содержании коров наступает угнетение иммунологической реактивности, а родившиеся от них телята имеют пониженный уровень гуморальных и клеточных факторов защиты организма (бактерицидная и лизоцимная активность сыворотки крови, фагоцитоз, уровень иммуноглобулинов, по сравнению с телятами, родившихся от коров, пользовавшихся выгулами и пастбищами [С. И. Плященко, В. Т. Сидоров, А. Ф. Трофимов, 1990].
Все новорожденные до приема молозива обладали достаточно выраженной фагоцитарной защитной реакцией. Показатели гуморальных факторов защиты формировались в более позднем возрасте и были выражены значительно слабее. До приема молозива сыворотка крови телят не обладала лизоцимной активностью и не содержала гаммаглобулинов [М. А. Сидоров, В. Н. Гущин, 1984].
На скорость роста телят положительное влияние оказывает 5-дневный период подсоса. Так, у таких телят были выше показатели естественной резистентности (лизоцимная активность, общий белок, глобулины, фагоцитарное число и фагоцитарный индекс) по сравнению с телятами, которых содержали с матерями только 12 ч [В. П. Павличенко, О. В. Милованов, Н. Н. Берникова, 1985].
Реактивность и адаптация сельскохозяйственных животных две взаимосвязанные проблемы; их надо изучать на организменном и иммуноцитологическом уровнях в комплексе со многими причинными факторами воздействующими на организм. Надо учитывать, что в каждом из указанных процессов лежат конкретные механизмы поддержания гомеостаза и адаптации, во многом еще не выясненные и требующие всестороннего изучения [А. Н. Голиков, 1989].
1.4. Получение и применение лактоглобулинов
В 1892 году P. Ehrlih впервые установил, что невосприимчивость к различным токсинам передается через молоко.
Исходя из того, что молозиво и молоко иммунизированных коров обладают выраженными превентивными свойствами, его использовали с профилактической и лечебной целью при соответствующих заболеваниях [C. Briggs, 1951; С. И. Губкин, А. И. Коган, 1971; J.E. Butler, C. Maxwele, 1972; P. Blackmer, 1973; D. M. Barber, 1978; D. M. Barber, 1979; J. J. Geene, 1984 В. Б. Билоштан, 1985; С. В. Вальциферова, 1997].
Из молока были получены иммунные лактоглобулины против сальмонелл, бруцелл, вируса ящура и полиомиелита [P. Lepine, 1963]. Эти препараты оказались пригодными для применения с лечебной и профилактической целью не только для телят, а и для обезьян. Автор приводит данные, подтверждающие преимущества применения лактоглобулинов по сравнению с цельными иммунными сыворотками молозива и крови.
Болгарские исследователи [К. Геров, П. Чушков, Р. Георгиева, 1965] изготовили из молозива препарат, который назвали лактоплазмин. По мнению авторов лактоплазмин содержит лактоглобулины, иммунные тела, витамины, микроэлементы и, являясь биологически ценным продуктом, может быть использован самостоятельно или в комбинации с другими средствами при заразных и незаразных болезнях молодняка, при которых понижается общая резистентность организма. Этот препарат является эффективным средством профилактики и лечения различных видов расстройств пищеварения у телят.
В ветеринарно-бактериологическом институте Бернского университета (директор профессор H. Fey) и научно-исследовательской лаборатории Бернской ветеринарной школы (заведующий Graub) из иммунного молозива изготовлен гамма-глобулиновый препарат (ГГП) или гамалин по Граубу [H. Fey, 1972].
Давая обзор работам, проведенным в этих учреждениях и анализируя литературу по методам получения и результатам изучения свойств ГГП, [K. Walser und H. Brumer, 1987] отмечают высокую терапевтическую и профилактическую эффективность применения этого препарата при инфекционных заболеваниях сельскохозяйственных животных. Они полагают, что наиболее результативным будет применение препарата при колиинфекциях и энтеротоксемиях.
Из молозива коров, иммунизированных внутривыменно против паратифа А. Ф. Барабаш, 1966, выделил путем осаждения сернокислым аммонием специфический противопаратифозный лактоглобулин. Полученный препарат применялся парентерально и показал выраженные профилактические и лечебные свойства на лабораторных животных и телятах.
Из молока коров, вакцинированных внутривыменно ящурным антигеном изготовили иммунолактон против вируса типа А, а затем изготовили бивалентный иммунолактон против вируса типа А и О [В. П. Онуфриев, В. К. Журавлёв, К. В. Чунаев, А. И. Дудников, Ю. Ф. Швецов, Б. П. Мартьянов, 1967]. Введение иммунолактона лабораторным животным, поросятам и телятам в дозе 0,5-1,5 мг на кг массы тела предохраняло животных от заболевания ящуром. Авторы указывают, что от одной коровы со средней продуктивностью 10 л молока в сутки в течение месяца можно изготовить иммунолактон в количестве, которое предохранит от ящура 300 телят или 800 поросят.
Иммунизируя стельных коров вначале подкожно концентрированным адсорбированным столбнячным анатоксином, а затем и внутривыменно нативным столбнячным анатоксином, получили сыворотку молозива с наличием противостолбнячных антитоксинов 850-2000 АЕ/мл, из которой выделили лактоглобулин, обладающий выраженными профилактическими и лечебными свойствами в опытах на белых мышах, крысах, ягнятах, поросятах и жеребятах [B. C. Барабаш, 1968].
Из сыворотки молозива коров, иммунизированных внутривыменно пуллорным антигеном, путем осаждения сернокислым аммонием получен специфический лактоглобулин, обладающий профилактическими свойствами в опытах на белых мышах и на цыплятах 10-30-дневного возраста [М. Г. Кондратюк, 1970].
Из сывороток молозива коров, гипериммунизированных паратифозной вакциной и бруцеллезным антигеном для РА, путем высаливания сернокислым аммонием при 20 % насыщении, выделен специфический паратифозный и бруцеллезный лактоглобулин, из которого изготовили люминисцируюшие лактоглобулины для диагностики паратифа телят и экспресс-индикации бруцелл [В. А. Атамась, 1968; В. А. Атамась, 1969].
Из сыворотки молозива коров, иммунизированных внутривыменно против диплококковой септицемии, получен специфический лактоглобулин и испытан с профилактической и лечебной целью в опытах на телятах. Противодиплококковый лактоглобулин обладал довольно выраженными профилактическими и лечебными свойствами [В. В. Май, 1970].
В ФРГ широко применяют гамма-глобулиновые препараты для профилактики и лечения колибактериоза и налажено промышленное производство гамма-глобулиновых препаратов из сыворотки убойных животных, сыворотки иммунизированных животных и молозива [R. Kruedener, 1970].
Из молока коров, гипериммунизированных внутривыменно модифицированным штаммом БУК вируса болезни Ауески получен иммунолактон против болезни Ауески [Д. Ф. Осидзе, В. К. Муравьев, В. Т. Ночевный, В. П. Онуфриев, В. М. Кравченко, 1972]. Авторы на основании проведенных исследований, установили принципиальную возможность диателической иммунизации коров штаммом БУК вируса болезни Ауески с целью получения специфической лактосыворотки и иммунолактона. Препарат в дозе 0,5-2,0 г/кг массы тела животного обладал выраженным профилактическим действием. Пассивный иммунитет у животных сохранялся 21 день. Лечебный эффект отмечали только после применения иммунолактона в первые двое суток после инфицирования животных.
Путем осаждения сернокислым аммонием молозивной сыворотки, был получен специфический лактоглобулин который обладал профилактическими и лечебными свойствами при экспериментальном и спонтанном заражении телят колибактериозом [Н. С. Жосан, 1974; Н. С. Жосан, 1976].
Для получения лактоглобулина [Е. В. Гублер, А. А. Генкин, 1978] использовали молозиво первого и второго удоев после отела коров. Молозиво подогревали до температуры 38-40° С, затем к нему добавляли свежеприготовленный раствор пепсина из расчета 100 мл на 900 мл молозива. После отделения молозивной сыворотки ее фильтровали через 4-5 слоев марли, затем через бумажный фильтр и консервировали 5 %-ным раствором фенола в 0,5 %-ном отношении к ее объему. Добавляли его при постоянном помешивании из расчета 11,1 мл на 100 мл препарата. Выпаивали лактоглобулин телятам в подогретом виде (38° С) в дозе 100-120 мл, первый раз за 30 мин до кормления молозивом, второй к концу первых суток. Больным животным после голодной диеты (8-9 ч) его давали утром до кормления один раз в сутки 2-3 дня в такой же дозе.
Из сыворотки крови отелившихся коров, находившихся в родильном отделении не менее 10 дней В. П. Павлов, Т. Н. Грязнева, Е. В. Чичикова, 1988, изготовили гаммаглобулин. Кровь брали у клинически здоровых животных (до 2 л от каждого). Из сыворотки крови готовили гаммаглобулин, используя 3 %-ный раствор этакридина лактата. Новорожденным телятам через каждые 3 дня инъецировали специфический гаммаглобулин внутримышечно в дозе 1 мл/кг массы тела, декстрофан и тривит в дозах соответственно 5 мл и 2 мл внутримышечно, а также в течение трех суток 2 раза в день внутримышечно вводили гентамицин в дозе 1,5 мг/кг массы, что позволило профилактировать желудочно-кишечные болезни у 100 % животных.
Для коррекции иммунодефицита неонатальных телят использовали колостральную сыворотку и лактоглобулин. [Н. С. Жосан, 1992]. Препараты вводили внутримышечно или подкожно, в дозе по 0,5 мл на кг живой массы дважды с интервалом 24 ч. Данные препараты повышали естественную резистентность организма, содержали неспецифические антитела против энтеропатогенов циркулирующих, в каждом конкретном хозяйстве при условии изготовления колостральной сыворотки и лактоглобулина, из молозива, полученного от коров данного хозяйства.
Применение молозива и его производных (молозивный иммуногормональный препарат, молозивная сыворотка, гидролизат казеина) снижает заболеваемость телят диареей на 50-60%, при этом болезнь протекает в легкой форме со 100% выздоровлением. Парентеральное введение этих препаратов новорожденным телятам способствует повышению уровня белка в сыворотке крови в 1,5 раза, иммуноглобулинов в 2 раза, уровень лейкоцивот у этих животных не превышал 8000, бактериальная загрязненность фекалий была в 2-3 раза ниже, чем у телят, которым молозиво давали только внутрь. Максимальный лечебно-профилактический эффект молозивная терапия дает в том хозяйстве, где молозиво было получено [В. В. Бурсуков, 1993; С. В. Вальциферова, 1997].
Исходя из литературных данных, следует отметить, что иммунное молозиво, молоко и полученные из них препараты обладают выраженными профилактическими лечебными свойствами.
Сравнительная дешевизна сырья, используемого для получения препаратов из молозива (практически оно не используется в хозяйствах) [М. Х. Шайхаманов, В. П. Грамолин, Б. М. Авакаянц, 1993], простота изготовления, высокая эффективность послужит основанием для получения указанных препаратов в производственных условиях.
заключение
Анализируя данные литературы, касающиеся состояния естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозе, необходимо выделить следующие основные моменты:
колибактериоз занимает среди заболеваний новорожденных животных одно из ведущих мест и наносит значительный экономический ущерб;
высокий уровень резистентности обеспечивает широкий диапазон ответных реакций организма на влияние различных факторов внешней среды в том числе и микроорганизмов, позволяющих ему адаптироваться на уровне физиологической реактивности;
животные с низким уровнем неспецифической резистентности не способны адаптироваться к изменившимся условиям внешней среды, что часто вызывает истощение резервной защитно-приспособительной реактивности и, как следствие этого, приводит к гибели животных;
сущность защитных факторов против колибактериоза телят ассоциируется с лактоглобулиновой фракцией и уровнем К-антител-агглютининов в сыворотке молозива коров и в сыворотке крови новорожденных телят;
фагоцитирующие лейкоциты, лизоцим, комплемент, пропердин и иммуноглобулины обладают функцией антител, противомикробное действие которых в совокупности выражается бактерицидной активностью сыворотки крови;
уровень иммуноглобулинов является одним из важных показателей резистентности организма новорожденного. При этом следует определять и учитывать иммунный статус до первой выпойки молозива и после его скармливания;
абсорбция колостральных иммуноглобулинов находится в прямой зависимости от ряда факторов важнейшими из которых являются: способность новорожденных телят усваивать их из молозива, условия внешней среды, качество молозива и своевременная выпойка первого молозива в адекватном количестве;
лактоглобулин совместно с ретинолом отличаются высоким иммуно-корректирующим эффектом и широтой профилактического действия;
аминазин совместно с Т-активином обладают иммуно-корректирующим действием и антисекреторной активностью ингибирующей трансформацию аденозинтрифосфата (АТФ) в циклический 3,5-аденозинмонофосфат (АМФ).
РАЗДЕЛ 2 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы и методы исследований.
2.1.1.Общая методика. Экспериментальная часть работы выполнялась на ферме крупного рогатого скота учебно-опытного хозяйства «Кетросу», района Анений Ной, ОПХ «Колоница» района Криулень и в лаборатории микробиологии кафедры эпизоотологии Государственного aграрного университета Молдовы с 1973 по 1998 год.
Опыты проводились на коровах черно-пестрой породы 5-8 лактации и на родившихся от них телят, с целью изучения состояния неспецифической и специфической иммунологической реактивности новорожденных телят при колибактериозе, а также выявления роли кислотно-основного баланса в течение инфекционного процесса, коррекции иммунодефицитного состояния новорожденных телят. Для лечения применяли антисекреторные препараты, ингибирующие циклический аденозинмонофосфат.
Пробы молозива отбирались в первый день (из первого, второго и третьего доения), на второй, пятый день после отела, а на десятый, двадцатый день и через месяц исследовалось молоко.
В сыворотке крови, молозиве и молоке изучались: динамика накопления агглютининов, иммуноглобулиновый уровень, в т. ч. в динамике.
Сыворотку крови получали путем отстаивания, а из молозива — методом пепсинизации. Из сывороток молозива первого и второго дня после отела выделяли колостральную сыворотку и лактоглобулин. У родившихся телят от опытных и контрольных групп коров в сыворотке крови изучали: динамику накопления О- и К- антител-агглютининов, уровень иммуноглобулинов в зависимости от клинического статуса, показатели фагоцитоза, пропердина, комплиментарной и бактерицидной активности (до поения молозивом, на 2, 5, 10, 20 и 30 день жизни).
Бактерицидные свойства колостральной сыворотки и сыворотки крови новорожденных телят изучали нефелометрическим методом. Профилактические и лечебные свойства молозивных сывороток и лактоглобулина изучались на лабораторных животных и телятах.
Коррекцию иммунодефицита неонатальных телят, проводили с применением лактоглобулина и витамина А.
В качестве анти-секреторных факторов, ингибирующих циклический аденозинмонофосфат (сАМР) применяли хлорпромазин и Т-активин.
Опыты проводились на 562 телятах, 468 коровах, 247 белых мышах и 30 кроликах.
Полученный цифровой материал подвергался биометрической обработке по различным биометрическим методикам: [Дж. У. Снедекор, 1961; И. П. Ашмарин, А. А. Воробьев, 1962; В. Ю. Урбах, 1964; Е. В. Гублер, А. А. Генкин А. А., 1969].
2.1.2. Приготовление колибактериозного антигена. Для приготовления антигена использовали три серотипа колибактерий: О78:К80, О119:К69 и О137:К79.
Использованные серотипы Е. coli по морфологическим и биохимическим свойствам были типичными, отвечающими требуемым иммуногенным, антигенным н вирулентным свойствам.
Е. coli О78:К80, О119:К69 и О137:К79 раздельно высевали в пробирки с мясопептонным бульоном на 12 ч и проверяли на чистоту (микроскопия мазков, окрашенных по Граму). В последующем бульонную культуру высевали на стерильный мясопептонный агар в матрацах. Посевы выращивали в термостате в течение 18 ч при температуре 37° С, проверяли на чистоту и смывали стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Для выделения О-антигена бактериальную суспензию автоклавировали при 120°С в течение 2 ч дня разрушения К-антигена. Густую отмытую суспензию Е. coli содержащую 10 млрд. микробных тел в 1 мл по оптическому стандарту, смешивали с ацетоном в отношении 1:5 до появления коагуляции (свертывания). Плотную часть материала отбирали на воронке Бюхнера, промытой один раз ацетоном и затем высушенной эфиром. Препарат высушивали на воздухе и хранили при 4°С.
Сухой порошок применяли для приготовления суспензии антигена, добавляя 1 мг высушенных ацетоном бактерий на 1 мл барбиталового буфера.
Для выделения К-антигена бактериальную суспензию получали путем смыва из агаровых культур изотоническим раствором хлорида натрия, содержащего 0,5 % формальдегида. Бактерии были экстрагированы при добавлении ацетона непосредственно после их смыва с агаровой культуры и промыты. [E. Neter, E. A. Gorzynski, R. M. Gino, O. Westphal and O. Luderwitz. 1956; E. Neter, 1957].
Полученные О- и К-антигены проверяли на стерильность и на безвредность. Стерильность устанавливали путем высева на МПБ, МППБ и МПА. Посевы выдерживали 10 дней в термостате (+37°С). Безвредность антигенов была проверена на лабораторных животных. Для этого каждый из антигенов вводили 10 белым мышам под кожу в области спины по 0,5 мл и 5 морским свинкам в области внутренней поверхности задней конечности по 1,0 мл. Клинические наблюдения за опытными животными вели в течение 15 дней.
Отсутствие роста в посевах на МПБ, МППБ и МПА и гибели привитых животных позвонило считать антигены стерильными и безвредными. Хранились антигены при температуре +4 +5°С в холодильнике.
2.1.3. Изучение агглютиногенных свойств серотипов О78:К80, О119:К69 и О137:К79 Е. coli. Для определения агглютиногенности изучаемых серотипов использовали 30 кроликов, по 5 на каждый серотип (определение О- и К-антигенов). Антигены вводили кроликам в краевую вену уха в нарастающих дозах (от 0,5 до 2,0 мл) с интервалом в три дня, четырехкратно.
Для определения О-антигена смешивали одну каплю антигена с одной каплей соответствующей О-сыворотки на зеркальном стекле, размещали над водяной баней при 60°С. Результаты учитывали через 10 мин после смешивания.
Позитивную реакцию подтверждали пробирочной агглютинацией, применяя формалинизировавную шестичасовую культуру в МПБ. Основное разведение сыворотки 1:10.
Для определения К-антигена культуру вначале тестировали пластинчатой реакцией агглютинации на предметном стекле. Одну каплю живой суспензии культуры смешивали с одной каплей различных антисывороток. Результаты учитывали в течение 30с после смешивания. Позитивную реакцию подтверждали пробирочной агглютинацией до титра тест сыворотки, применяя как антиген живую пятичасовую культуру в МПБ. Пробирки инкубировали при 37°С два часа, в последующем агглютинационные пробирки центрифугировали при 2000 об/мин в течение трех минут. Одинаковый писк агглютинации учитывали как позитивную реакцию. [E. Neter, E. A. Gorzynski, R. M. Gino, O. Westphal and O. Luderwitz. 1956; E. Neter, 1957].
2.1.4. Получение сыворотки крови, молозива и молока. Кровь от животных (коров, телят) брали из яремной вены в стерильные пробирки и помещали в термостат (+37°С) на 3 ч, после чего выдерживали 12-16 ч при комнатной температуре до полного отделения сыворотки. Затем сыворотку отсасывали в стерильные пробирки и помещали в холодильник (+4 +5°С).
Молозиво от коров брали при первом, втором и третьем доении после отела, а затем на второй, пятый, десятый, двадцатый дни и через месяц.
Сыворотку из молозива и молока получали путем добавления пепсина. На каждые 1000 мл молозива или молока добавляли 100 мл 0,5% раствора пепсина и после тщательного перемешивания смесь помещали в водяную баню при температуре 38° С на четыре часа. Образовавшийся сгусток, отделяли от сыворотки фильтрацией через три слоя марли. Полученную сыворотку пропускам через воронку Бюхнера с двойным слоем бедой фильтровальной бумаги, а затем через бактериальный фильтр Зейтца.
2.1.5. Реакция атглютинации с молозивной и молочной сыворотками. В центрифужные пробирки наливали 5-6 капель 5 % раствора пепсина, приготовленного на изотоническом растворе хлорида натрия и 10 мл исследуемого молозива или молока, тщательно перемешивали и для свертывания ставили в термостат при температуре 38°С на 30 мин. Свернувшееся молозиво отделяли от стенок пробирки стеклянной палочкой и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин.
С полученной сывороткой ставили реакцию агглютинации в объеме 1 мл в разведениях с физиологическим раствором от 1:10 до предельного титра сыворотки. Контроли обычные.
Антиген добавляли по 0,05 мл в каждую пробирку, пробы встряхивали и помешали в термостат при температуре 37°С на 4 ч, после чего производили предварительный учет реакции, а окончательный учет реакции определяли через 24 ч. Молозиво исследовали в день его получения.
2.1.6. Определение титра агглютининов. Для изучения динамики накопления агглютининов в сыворотках крови и молозива использовали реакцию агглютинации, которую ставили в объеме 1 мл (классическим методом) в пробирках с ровным округлым дном с убитыми и живыми О- и К-антигенами (серотипы О78:К80; О119:К69; О137:К79 Е. coli ).
Для определения агглютинационных титров, в наших исследованиях применяли двукратное разведение сывороток. Разведение сывороток крови и молозива производили в агглютинационных пробирках начиная с разведения 1:10.
После добавления антигена (по 0,05 мл) содержимое пробирок встряхивали, затем помещали в термостат на 4 ч при температуре 37°С. После этого производили предварительный учет результатов реакции. В дальнейшем пробирки выдерживали 24 ч при комнатной температуре и определяли окончательный результат.