Активность основных карбокмипептидаз в тканях пренатально алкоголизированных крыс

ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В. Г. БЕЛИНСКОГО

На правах рукописи

Мухина Елена Станиславовна

АКТИВНОСТЬ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ ПРЕНАТАЛЬНО АЛКОГОЛИЗИРОВАННЫХ КРЫС

03.00.04 – Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук профессор Генгин М. Т.

ПЕНЗА 2003

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………….……………….…...4

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….….……5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………….…...8

1.1. Влияние хронической алкоголизации на организм ……………………...8

1.2. Влияние пренатального хронического воздействия этанола на организм…………………………………………………………………..……..16

1.3. Ферменты обмена регуляторных пептидов …………………………...…21

1.3.1. Биологическая роль пептидаз…………………………….……………..21

1.3.2. Карбоксипептидаза Н…………………………………………………....23

1.3.3. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза………….……..……………28

1.4. Регуляторные пептиды и ферменты их обмена в онтогенезе…...…..….31

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………….37

2.1. Материалы исследования…………………………………………..……...37

2.2. Методы исследования………………………………………………………37

2.2.1. Моделирование хронического потребления этанола………………....37

2.2.2. Метод определения активности ферментов……………………….…..38

2.2.3. Метод проведения теста «открытое поле»…………………….……....39

2.2.4. Статистическая обработка результатов исследования………………....40

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………….……..…41

3.1. Исследование активности основных карбоксипептидаз в тканях крыс разного возраста, испытавших пренатальное воздействие этанола...……….41

3.1.1. Исследование активности карбоксипептидазы Н в тканях пренатально алкоголизированных крыс разного возраста………..……………………….41

3.1.2. Исследование активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях пренатально алкоголизированных крыс разного возраста………….49

3.2. Исследование влияния хронической алкоголизации на активность основных карбоксипептидаз в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола……………………...……………………..57

3.2.1. Исследование поведения пренатально алкоголизированных животных в тесте «открытое поле»………………………………………………..…………57

3.2.2. Исследование влияния хронической алкоголизации на активность карбоксипептидазы Н в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола………………………….……………………………..…..61

3.2.3. Исследование влияния хронической алкоголизации на активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола ……………………………..68

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ……………74

ВЫВОДЫ…………………………………….…………………………………..88

ЛИТЕРАТУРА….………………………………………………………………..91

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДГ – алкогольдегидрогеназа

АКТГ – адренокортикотропный гормон

АПМЯК – аминопропилмеркаптоянтарная кислота

АПФ – ангиотензинпревращающий фермент

ВИП – вазоактивный интестинальный пептид

ВНД – высшая нервная деятельность

ГАМК – гамма-аминомасляная кислота

ГОМК – гамма-оксимасляная кислота

ГГС – гипоталамо-гипофизарная система

ГГГС – гипоталамо-гипофизарно-гонадная система

ГГНС – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система

ГПЯК – гуанидинопропилянтарная кислота

ГЭМЯК – гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота

КП – карбоксипептидаза

КПN – карбоксипептидаза N

КПВ – карбоксипептидаза В

КПН – карбоксипептидаза Н

КРФ – кортикотропин-рилизинг фактор

НАД – никотинамидаденин динуклеотид

НАДФ – никотинамидадениндинуклеотид фосфат

ПОМК – проопиомеланокортин

Р0, Р14, Р28, Р45, Р120 – возраст животных (0, 14, 28, 45 и 120 суток после рождения, соответсвенно)

ФМСФ – фенилметилсульфонилфторид

ФМСФ-КП – фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза

ЦНС – центральная нервная система

ЭДТА – этилдиаминтетраацетат натрия

ВВЕДЕНИЕ

Для современной биологии и медицины имеет особую значимость исследование общих и частных закономерностей развития алкоголизма. Решение указанных вопросов позволит раскрыть патогенетические механизмы этого заболевания и разработать эффективные способы его профилактики и лечения.

Одним из важных аспектов проблемы алкоголизма является исследование нарушений, происходящих в организме потомков алкоголиков, и формирования у них предрасположенности к алкоголизму. При этом вызывают интерес процессы, происходящие в онтогенезе. Известно, что в ходе индивидуального развития организма происходит зависящая от пола перестройка различных функциональных и, особенно, регуляторных систем: нервной и эндокринной [12]. Эта перестройка сопровождается значительными изменениями в функционировании пептидергических систем, например опиоидных, что, несомненно, связано с изменением активности ферментов, участвующих в обмене биологически активных пептидов [1, 25, 52, 55, 76, 212, 278].

Биологически активные пептиды функционируют в качестве гормонов, нейрогормонов, нейромодуляторов, нейромедиаторов [76], вовлекаясь в регуляцию практически всех процессов, протекающих в организме, а также в развитие многих патологических процессов [76, 120]. Известна роль многих регуляторных пептидов, особенно опиоидных пептидов, в патогенезе алкоголизма [7, 13, 18, 62, 69, 120, 128, 272].

Уровень биологически активных пептидов в организме во многом зависит от активности ферментов, участвующих в процессинге их предшественников, модуляции и инактивации [35, 48, 52, 56, 115, 126, 140, 142, 160, 172, 174, 205].

К ферментам, участвующим в метаболизме регуляторных пептидов, относятся, в частности, основные карбоксипептидазы – это экзопептидазы, катализирующие отщепление остатков аргинина и лизина с С-конца пептидов. К ним относятся карбоксипептидаза В (КФ 3. 4. 17.1 ), карбоксипептидаза Н (КФ 3. 4. 17. 10), карбоксипептидаза М (КФ 3. 4. 17. 12), карбоксипептидаза N (КФ 3. 4. 17. 3), лизосомальная карбоксипептидаза В (КФ 3. 4. 17. 2), ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза и некоторые другие.

На настоящий момент возрастные и половые изменения активности ферментов обмена регуляторных пептидов, происходяшие в онтогенезе у потомков алкоголиков не изучены. Также нет данных об изменениях активности этих ферментов у пренатально алкоголизированных особей при последующем воздействии этанола в постнатальном периоде.

Целью нашей работы было изучение роли основных карбоксипептидаз в развитии предрасположенности к формированию алкогольной зависимости у потомков алкоголиков.

При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

Исследовать активность карбоксипептидаз Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях пренатально алкоголизированных животных разного возраста.

Исследовать влияние хронической постнатальной алкоголизации на активность основных карбоксипептидаз в тканях взрослых крыс, подвергавшихся и не подвергавшихся воздействию этанола в эмбриональном периоде жизни.

Сравнить влияние алкоголизации на активность КПН и ФМСФ-КП у животных разного пола.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые изучено влияние пренатальной алкоголизации на активность КПН и ФМСФ-КП в тканях самок и самцов крыс. При этом исследована ферментативная активность как у взрослых животных, так в период их полового созревания. Установлена зависимость изменения активности КПН и ФМСФ-КП от пола и возраста животных. Показано половое отличие изменения активности ферментов в тканях пренатально алкоголизированных животных при постнатальной хронической этанольной интоксикации.

Полученные результаты представляют интерес для понимания механизмов функционирования пептидэргических систем и роли основных карбоксипептидаз в норме и при алкоголизме.

Положения, выносимые на защиту:

На основе анализа возрастной динамики, регионального распределения активности карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы и сравнения их с уровнем биологически активных пептидов, обсуждается биохимическая функция данных ферментов.

Пренатальная алкоголизация вызывает изменение активности исследованных ферментов в мозге и периферических тканях животных обоего пола в процессе развития.

Пренатальная алкоголизация модулирует изменение активности КПН и ФМСФ-КП при последующей постнатальной алкоголизации взрослых особей.

Предложена гипотетическая схема одного из возможных механизмов формирования предрасположенности к алкоголизму у пренатально алкоголизированных особей с участием исследованных ферментов.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 2-ой Всеросийской научно-практической конференции (Волгоград, 2003) и итоговых научных конференциях профессорско-преподавательского состава Пензенского Государственного Педагогического Университета (2002, 2003 г.г.). По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 6 разделов: введение, обзор литературы по теме диссертации, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы. Работа изложена на 122 страницах, иллюстрирована 16 рисунками и 13 таблицами. Список литература содержит 353 наименования на русском и иностранных языках.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Влияние хронической алкоголизации на организм

Эндогенные этанол и ацетальдегид являются одной из важных метаболических систем организма животных и человека, обмен этих веществ – неотъемлемая часть систем поддержания гомеостаза [21, 24, 63, 71, 92, 176, 184, 314, 329].

Экзогенный этанол, поступающий в организм животных и человека, окисляется тремя ферментативными системами: 1) алкогольдегидрогеназой с участием НАД, метаболизирующей 75-90 % поступившего этанола; 2) микросомальной этанолокисляющей системой с участием НАДФ и О2, окисляющей ~ 10 % этанола; 3) каталазой, окисляющей ~ 2 % этанола [78, 81, 82, 89, 336].

При хронической алкоголизации происходит изменение активности ферментов окисления этанола, что приводит к нарушению баланса между образованием и утилизацией ацетальдегида, что в свою очередь существенно сдвигает уровень ацетальдегида в крови [14, 24, 58, 97].

Важно отметить существование половых генетических отличий активности ферментов, участвующих в метаболизме этанола [15, 22, 105, 107, 197].

Этанол и его метаболиты влияют на белки нервной ткани, печени, крови, сердца и др. тканей [98].Отмечаются зависящие от дозы и длительности воздействия этанола, нарушения белкового синтеза и катаболизма [112]. Эти изменения отличаются в различных отделах мозга и субклеточных структурах [2, 23, 61].

Формирование алкоголизма сопряжено с нарушением ряда физиологических функций, в регуляции которых значительную роль играют эндогенные олигопептиды. Выявлено участие отдельных олигопептидов (окситоцина, вазопрессина, нейротензина, бомбезина, дельта-сон-индуцирующего пептида, холицистокинина, опиоидных пептидов, АКТГ и др.) в развитии толерантности и физической зависимости от этанола, а также в формировании алкогольного абстинентного синдрома. Установлено участие биологически активных пептидов (ангиотензина-ІІ, брадикинина, β-эндорфина, энкефалинов и дельта-сон-индуцирующего пептида) в механизмах формирования и реализации алкогольной мотивации [65]. Так, известно, что хронический этанол усиливает секрецию АКТГ и пролактина и снижает секрецию соматотропного гормона [3, 297], увеличивает экспрессию мРНК КРФ в гипоталамусе [297], увеличивает концентрацию КРФ и АКТГ в ГГС [98]. По другим данным [296] хроническая алкоголизация снижает содержание КРФ в гипоталамусе. Также отмечается повышаение уровеня мРНК препротахикинина в вентральной оболочке, без изменения его в стритуме [260], нарушение синтеза в мозге дельта-сон-индуцирующего пептида [24]. Ацетальдегид стимулирует синтез КРФ и экспрессию мРНК аргинин-вазопрессина в паравентрикулярном ядре гипоталамуса [228].

Особо важно отметить влияние этанола на эндогенную опиоидную систему организма и ее участие в патогенезе алкоголизма. Причастность опиоидных пептидов к реализации эйфорического эффекта, эмоционального восприятия, условнорефлекторной и других форм ВНД с одной стороны, и предположения о реализации через пептидергические нейроны, эпилептиморфных свойств этанола, а также характерных для синдрома алкогольной абстиненции тремора, судорог и галлюцинаций с другой, свидетельствуют о существенной роли опиоидных пептидов в патогенезе алкоголизма [80].

Установлено, что хроническое употребление алкоголя заметно снижает плотность и сродство опиатных рецепторов к своим природным лигандам [79, 133, 135]. Отмечается влияние эстрадиола и прогестерона на этот эффект этанола в гипоталамусе, среднем мозге и коре, что частично объясняет половые отличия алкогольных эффектов [133].

При хронической алкогольной интоксикации снижается содержание некоторых опиоидных пептидов в отделах мозга [9, 18, 24, 84, 146, 348], что является отражением процесса адаптации опиоидной системы к избыточной стимуляции, приводящей к снижению функциональной активности этой системы [9, 18, 84].

Обращает на себя внимание несогласованное снижение уровней разных опиоидных пептидов под действием хронической алкоголизации в разных отделах мозга [9, 18, 24, 84, 146, 348] и данные даже об увеличении концентрации β-эндорфина [98] и экспрессии мРНК ПОМК [228]. Панченко Л. Ф. с соавт. [80] считают, что с такого дисбаланса в опиоидной системе мозга начинается формирование зависимости и толерантности к алкоголю, далее в процесс вовлекаются сопряженные с ней нейромедиаторные и нейромодуляторные системы мозга, что нарушает слаженную работу мозга в целом. Абстинентный синдром усугубляет опиоидный дефицит [125, 198].

Опосредование механизмов действия этанола на организм через нейропептиды подтверждается также данными о влиянии биологически активных пептидов на потребление алкоголя и изменение ими эффектов, вызванных этанолом. Так холецистокинин, бомбезин [235, 233], тиролиберин [234], кортикотропин-рилизинг фактор [120], ангиотензин ІІ, брадикинин, Leu-энкефалин, энкефалиноподобный тетрапептид, дельта-сон-индуцирующий пептид [65], Met-энкефалин [54] снижают потребление алкоголя; вазоактивный интестинальный полипептид, нейропептид Y, галанин, β-эндорфин увеличивают потребление этанола [235]; вещество Р частично нормализует нарушенные этанолом центральные механизмы реакции избегания [60;].

Важным хроническим действием этанола на нейропептиды является изменение активности различных ферментов их обмена [11, 67, 211, 324, 332].

Отмечается увеличение активности КПН в гипофизе [28, 32, 45], гипоталамусе и стриатуме крыс [28, 32]; уменьшение активности АПФ в гипоталамусе и стриатуме [28]. Хроническая алкоголизация и ее отмена увеличивают активность АПФ в гипофизе и стриатуме немурицидных крыс и в гипофизе мурицидных крыс [53]; увеличивают активность КПН в гипофизе, стриатуме и среднем мозге у немурицидных крыс [53]. Исходно различная активность ферментов в мозге для мурицидных и немурицидных крыс выравнивается в процессе потребления этанола и его отмены до уровня, характерного для мурицидных крыс [53].

Совместное воздействие этанола и стресса вызывает гиперактивацию КПН в гипоталамусе, стриатуме и среднем мозге крыс [32].

Хроническое воздействие этанола повышает активность КПН в гипофизе и стриатуме предпочитающих воду и предпочитающих этанол крыс и снижает ее в гипоталамусе и таламусе предпочитающих воду крыс; увеличивает карбоксипептидазо-В подобную активность в среднем мозге и стриатуме крыс; увеличивает активность АПФ в гипофизе и стриатуме и снижает в гипоталамусе и таламусе предпочитающих воду крыс [54].

Активность этих ферментов (КПН, АПФ) изменяется в направлении, которое способствует повышению уровня биологически активных пептидов [28].

Хроническая алкоголизация вызывает повышение активности ферментов, участвующих в метаболизме β-эндорфина в среднем и переднем мозге мышей [146], увеличение активности энкефалинконвертазы А в среднем мозге, гипоталамусе и стриатуме крыс [19].

По данным Беляева Н. А. с соавт. [20] хроническая алкоголизация вызывает в коре больших полушарий снижение удельной активности растворимой и мембраносвязанной форм энкефалинконвертазы, а в стриатуме – снижение удельной активности растворимой и увеличение активности мембраносвязанной формы фермента. Привлекает внимание, что, и изменение общей ферментативной активности имеет сходную направленность. Нарушения, происходящие при хронической алкоголизации, могут быть вызваны как снижением способности фермента гидролизовать субстрат, так и совместным изменением каталитических свойств фермента и его содержания в соответствующем биологическом образце. Авторы полагают, что изменение активности фермента происходит из-за нарушения метаболизма фермента, а в случае мембраносвязанной формы фермента, возможно, и изменения липидного состава нейрональных мембран.

Следует подчеркнуть, что максимальное изменение активности энкефалинконвертазы, КПН, АПФ и др. ферментов обмена нейропептидов обнаружены в среднем мозге, гипоталамусе, стриатуме – отделах, имеющих наиболее важное значение для развития толерантности к алкоголю и зависимости от него. Представляется вероятным вовлечение этих ферментов в патогенез алкоголизма.

Некоторые противоречия данных, касающихся изменения активности ферментов обмена нейропептидов и несогласованность с изменением уровня нейропептидов, в частности, Leu-энкефалинов и Met-энкефалинов в зонах мозга животных и человека, длительно потребляющих этанол, значительно зависят от сроков и формы применявшейся нагрузки этанолом (с пищей, искусственное введение внутрь, добровольное потребление) [12, 54]. Отмечается так же, что количество определяемого пептида является, по сути, интегративной величиной соотношения нейропептидобразующей и нейропептиддеградирующей активности в конкретном нейрональном регионе. Непосредственное определение активности пептидаз, проведенное в единичных исследованиях показывает неоднозначность таких изменений, трактовка которых представляется затруднительной.

При хронической алкоголизации в мембранах клеток происходит уменьшение степени ненасыщенности липидов мембран, увеличение в мембранах содержания холестерина, уменьшение количества мембраносвязанных аминогликанов. Эти физико-химические изменения, не зависящие от тканевой принадлежности клеток (кровь, печень, центральная нервная система), позволяют компенсировать флюидизирующее действие этанола и лежат в основе механизмов развития толерантности клеток к воздействию этанола при его хроническом потреблении [12].

Изменения фазового состояния мембраны оказывают существенное влияние на процессы мембранного транспорта, на системы трансмембранной передачи информации, на активность мембраносвязанных ферментов [51, 91, 252, 265].

Анализ функционального состояния ГГНС у здоровых и страдающих алкоголизмом людей, а также данные, полученные в экспериментах на разных животных под влиянием хронической алкогольной интоксикации, свидетельствуют о выраженном влиянии этанола на разные компоненты этой системы [24, 66].

При хронической алкоголизации наблюдается изменение функционирования ГГНС. Вначале происходит нарушение на уровне гипоталамуса и гипофиза. Это приводит к гиперсекреции АКТГ, который действует на клетки коры надпочечников, стимулируя синтез кортикостероидов [24, 123, 222, 276, 320, 321]. Затем фаза первичного повышения секреции этих гормонов сменяется развитием толерантности, адаптации ГГНС к стимулирующему действию этанола [24, 122, 209, 321]. Причем снижение функционирования ГГНС, наблюдаемое у экспериментальных животных носит возрастозависимый характер [189, 345]. Развитие относительной недостаточности адренокортикальной функции при алкогольной интоксикации обусловлено прямым токсическим действием алкоголя и продуктов его метаболизма на продукцию глюкокортикоидов в надпочечниках и влиянием на процессы биосинтеза и высвобождения АКТГ в гипофизе, а также на нейротрансмиттерные системы, регулирующие синтез и высвобождение кортиколиберина в гипоталамусе [24].

Кроме АКТГ, хроническая алкоголизация влияет и на другие пептиды ГГНС [276, 290, 304].

Хроническая алкоголизация снижает уровень лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов в плазме крови у самок и самцов крыс [298, 305]. У самцов при этом в гипофизе не изменяется концентрация этих гормонов и гонадотропин-рилизинг гормона, но снижается количество пролактина. В семенниках снижается содержание рецепторов лютеинизирующего гормона, повышается содержание рецепторов фолликулостимулирующего гормона и не изменяется содержание рецепторов пролактина и гонадотропин-релизинг гормона [305].

Отмечаются половые отличия в формировании алкогольной зависимости.

В процессе развития экспериментального алкоголизма уровень потребления этанола выше у самок крыс по сравнению с самцами, хотя предпочтение быстрее формируется у самцов [106, 141, 214, 294]. В то же время есть данные о том, что самцы макак пьют больше, чем самки [343]; крысы обоего пола потребляют этанол в одинаковых количествах, но у самок дольше поддерживается предпочтение к этанолу [113]. У самцов мышей выше, чем у самок, чувствительность к хроническому седативному гипнотическому действию этанола [293]. У самок крыс при более медленном развитии зависимости от этанола происходит более быстрое восстановление, чем у самцов [148]. У женщин отмечается более высокий уровень алкоголя в крови, чем у мужчин при приеме одинакового количества этанола [186, 337]. У людей обоего пола уровень потребления алкоголя зависит от генотипа [106, 306, 320] и возраста [306].

Установлено, что у самок животных выше чувствительность к вызванному алкоголем повреждению печени, а также чаще встречается полинейропатия и мозжечковая атаксия, чем у самцов [337].

Во время отмены этанола после его хронического потребления ЦНС самок крыс по сравнению с самцами более восприимчива к повреждению полиаминовых нейронов [288], более чувствительна к антиконвульсантному действию нейростероидов [149], и проявляет больший ответ на острое введение этанола [148]. Однако приводятся данные о меньшей чувствительности самок к отмене этанола, что частично объясняется влиянием эстрогена [215]. Влиянием половых гормонов также можно объяснить и другие факты половых отличий при абстинентном синдроме [216, 217].

Хроническое потребление алкоголя самками изменяет соотношение стадий эстрального цикла, что свидетельствует о нарушении гипоталамических гормональных функций. У самок животных, по сравнению с самцами, отмечаются более выраженные изменения в кинетике этанола и ацетальдегида, что также способствует потреблению высоких доз этанола [4]. При развитии алкоголизма у самцов важна система положительного подкрепления мозга, а у самок – система, метаболизирующая этанол [4]. В частности имеются данные о половых отличиях экспрессии и стимуляции изоферментов АДГ [105, 215], причем в механизм этих отличий вовлекаются андрогены, оказывающие ингибирующее действие, а также прогестерон и эстроген, оказывающие стимулирующее действие [197]; алкоголизация не изменяет активность АДГ печени у животных обоего пола, но с повышением потребления этанола активность обоих изоферментов повышается.

Алкоголь по-разному действует на ГАМК-бензодиазепиновые рецепторы у этанол-зависимых мужчин и женщин [149, 240], но физиологические причины этого не ясны. Известно, что при хронической алкоголизации не изменяются уровни белка субъединиц ГАМК-рецепторов в коре этанол-зависимых самок крыс, в отличие от самцов, у которых эти уровни снижены [149].

У самцов и самок крыс наблюдается модулирующее (снижающее) влияние на предпочтение к этанолу, оказываемое дигидротестостероном и эстрадиолом [113].

Эстадиол и прогестерон влияют на способность этанола изменять кинетические параметры связывания μ-опиоидных рецепторов в отделах мозга (гипоталамусе, среднем мозге и коре), что частично объясняет половые отличия алкогольных эффектов [133].

Таким образом, хроническая алкоголизация является причиной многочисленных нарушений на органном, тканевом, клеточном и молекулярном уровнях. В частности, отмечаются нарушения в функционировании ферментных систем. Для понимания механизмов изменения активности ферментов при алкоголизме и роли этих изменений в формировании алкогольной зависимости интересно сравнить влияние хронической этанольной интоксикации на активность ферментов обмена биологически активных пептидов в тканях интактных и пренатально алкоголизированных крыс. Многочисленные данные о половых отличиях при хронической алкоголизации требуют сравнения изменений активности ферментов при этом у животных разного пола.

1.2. Влияние пренатального хронического воздействия этанола на организм

Этанол оказывает многостороннее действие на организм не только особей, непосредственно его потребляющих, но и их потомства.

Пренатальная алкоголизация формирует так называемый алкогольный синдром плода или синдром эмбриофетопатии. По современным представлениям – это сумма патологических симптомов, обусловленных аномалиями развития плода и функциональными нарушениями в результате потребления алкоголя матерью во время беременности. Особенно уязвимы те стадии, когда происходит дифференцировка органов и систем плода.

Несмотря на то, что в системе «мать-плод» имеются механизмы, способствующие уменьшению эффекта алкоголизации матери во время беременности на плод [26, 90, 227], этанол проходит через плаценту и плод подвергается алкогольной интоксикации.

В целом, при влиянии алкоголя на потомство выделяют следующие изменения: 1) повышение биологического риска формирования алкоголизма; 2) разнообразные соматические нарушения вплоть до тяжелой органической патологии – алкогольной эмбриофетопатии; 3) нарушение поведения, эмоциональных и психических функций [6, 26, 64, 130].

Высокий риск заболевания алкоголизмом у потомков алкоголиков объясняется изменением функции генома. В частности, могут происходить нарушения в активности систем генов, участвующих в развитии и дифференцировке нервных клеток. Критическим моментом формирования нейрофизиологических механизмов алкогольной зависимости и толерантности может быть влияние на экспрессию «ранних» генов, например гена c-fos – белка, являющегося продуктом экспрессии «раннего» гена, выполняющего роль «третичного мессенджера». В ответ на экстрацеллюлярную стимуляцию изменяется активность других генов, что приводит к долговременным перестройкам в нейронах мозга. Несмотря на то, что фоновый уровень экспрессии гена c-fos в структурах головного мозга одинаков у пренатально алкоголизированных и контрольных животных, постнатальное введение этанола вызывает мощное усиление экспрессии этого гена у потомков алкоголиков крыс в отличие от интактных животных [8].

Божко Г. Х. и Волошин П. В. [238] считают, что нарушение структуры и функции генетического аппарата клеток преимущественно обусловлено действием ацетальдегида. Алкогольная интоксикация вызывает формирование поперечных ковалентных связей между комплементарными нитями ДНК и между хроматиновыми белками, вызывает изменение синтеза гистонов и негистоновых белков, нарушая структуру хроматина.

Несмотря на то, что не выявлен конкретный ген или аллели, ответственные за эффекты алкоголя, исследования показывают зависимость питьевого поведения и риска развития алкоголизма от генов, кодирующих ферменты метаболизма этанола. Отмечаются генетические различия активности этих ферментов [15, 22, 107].

Пренатальная алкоголизация вызывает гиперреактивность и изменение обратной связи ГГНС [177, 178, 182, 224, 282]. Это проявляется в однократном и/или длительном повышении уровня АКТГ и/или кортикостерона, в том числе и в ответ на стресс, увеличении чувствительности надпочечников к АКТГ, изменение чувствительности гипофиза к КРФ [182, 282]. Причем этот эффект пренатального влияния этанола зависит от пола животного. У эмбрионально алкоголизированных самцов крыс гипоталамус оказывает больший стимулирующий эффект, и/или гипофиз более чувствителен к веществам, повышающим секрецию АКТГ, по сравнению с пренатально алкоголизированными самками и контрольными животными [182]. Пренатально алкоголизированные самки имеют более высокий уровень тревожности и более высокий уровень кортикостерона, чем пренатально алкоголизированные и контрольные самцы и контрольные самки [280, 281, 291]. У пренатально алкоголизированных самок, но не у самцов дексаметазон вызывает повышение уровней АКТГ и кортикостерона [177]. Aird et. al. [109] предполагают организационное влияние половых гормонов на эти эффекты алкоголя. У пренатально алкоголизированных самок, в отличие от самцов, наблюдается изменение возрастной динамики уровня мРНК КРФ в гипоталамусе по сравнению с контрольными животными. Адреналэктомия матерей, комбинированная с пренатальной алкоголизацией, вызывает изменение возрастной динамики уровня мРНК КРФ и у самцов и у самок.

У пренатально алкоголизированных самцов снижается уровень мРНК ПОМК, а у самок не изменяется. Адреналеэктомия матерей возвращает уровень мРНК ПОМК у самцов к норме, а у самок – снижает [109].

Пренатальное воздействие этанола изменяет действие половых гормонов и влияет на репродуктивную функцию самок и самцов. Подавляется секреция эстрогена у самок крыс [322]; нарушается увеличение количества клеток, экспрессирующих мРНК проэнкефалина в гипоталамусе самок крыс в ответ на введение эстрогена, наблюдаемое в норме [239]; снижается уровень тестостерона у самцов, если он вводится до или во время периода диффференциации гипоталамуса и семенников [265].

Важно отметить, что в пренатальном периоде на развивающийся организм, помимо собственных нейрогормональных факторов и вводимого этанола, оказывают влияние гормоны и нейрогормоны матери и плаценты. Введение этанола в состав жидкого корма с 8-го дня беременности изменяет гормональный статус матери: содержание пролактина почти не изменяется, а тестостерона и прогестерона – повышается [64]. Эти изменения, естественно, отражаются на развитии плода.

Пренатальная алкоголизация, внося глубокие изменения в организм на клеточном, тканевом и органном уровнях, проявляется в изменении поведения. У пренатально алкоголизированных животных отмечается гиперреактивность [309, 299] или снижение двигательной активности [70, 83, 241] с уменьшением общемозговой и гиппокампиальной массы [132, 309] и уменьшением размера таламуса [241]. У самок крыс наблюдается большая исследовательская активность, т. е. более высокий уровень тревожности, чем у самцов, и более высокий уровень кортикостерона [281]. Druse M. J. et. al. [153] отмечают нарушение моторной функции у пренатально алкоголизированных крыс, сопутствующее повышению уровня мРНК проэнкефалина в стриатуме и прилегающих ядрах и аномалии в черном веществе.

Пренатальное воздействие этанола влияет на многие нейрохимические и клеточные компоненты развивающегося мозга. Разные отделы мозга отличаются реакцией на токсичный эффект этанола. В одном и том же отделе разные клеточные популяции тоже проявляют разную чувствительность к этанолу. Этанольная интоксикация в эмбриональном периоде нарушает деление, рост, дифференциацию и миграцию клеток, развитие астроглии и нейронально-глиальное взаимодействие, повреждает нейротрансмитерные системы и/или их рецепторы [190, 269], является причиной гибели нейронов в гиппокампе [226], мозжечке [134], коре [232, 268], в вестибулярном комплексе [154], снижает уровень миелинизации [284]. Она влияет на ДНК, РНК и белковый синтез, снижает уровень митоза, изменяет содержание и распространение некоторых цитоскелетных белков, цитозольных и мембранных гликопротеинов [191, 208]. Пренатальная алкоголизация нарушает содержание различных нейропептидов в отделах мозга, в частности, нейротрофина (фактора роста нервов) и нейропептида Y [114]. Пренатальная интоксикация влияет на ферментативную активность в ЦНС: изменяет посттрансляционную модификацию оксиазотсинтазы-1 и -3, снижая их активность [225], уменьшает активность протеинкиназы С, что является причиной глубоких и длительных дефицитов в клеточных сигнальных механизмах, связанных с синаптической пластичностью и формированием памяти [111], подавляет экспрессию мРНК ферментов катехоламинергической системы [331] и т. д.

Особый интерес, вызывает изменение уровней опиоидов при пренатальной алкоголизации. Пренатальное воздействие этанола избирательно изменяет содержание энкефалинов в разных регионах мозга: повышает уровень проэнкефалина в стриатуме и прилегающих ядрах [153]; снижает количество Met- и Leu-энкефалинов в гипоталамусе без изменения в коре, гиппокампе [69]; увеличивает содержание Met- и Leu-энкефалинов в бледном шаре без изменения их содержания в гипофизе [263]. Такие изменения уровней энкефалинов в мозге, по мнению некоторых авторов [69], формируются в процессе постнатального онтогенеза и обусловлены не прямым действием этанола на систему эндогенных опиоидов, а развивается в результате опосредованных реакций.

Таким образом, можно заключить, что пренатальная алкоголизация оказывает существенное разнообразное влияние на организм. В том числе и на содержание биологически активных пептидов. При этом практически отсутствуют данные о влиянии пренатальной этанольной интоксикации на ферменты обмена этих пептидов, что вызывает интерес для исследования.

1.3. Ферменты обмена регуляторных пептидов

1.3.1. Биологическая роль пептидаз

В регуляции функций организма, наряду с классическими медиаторами, важная роль принадлежит регуляторным факторам пептидной природы. Регуляторные пептиды широко распространены в различных тканях, в том числе и в нервной. Они принимают участие в нейрохимических механизмах, поддерживающих основные гомеостатические константы организма, формирующих и осуществляющих целенаправленное поведение, а также в процессах, контролирующих эмоциональную сферу, мотивацию, память [5, 10, 75, 93, 104]. Вероятно, именно биологически активным пептидам принадлежит важная роль в интеграции функциональных систем организма, обеспечении их слаженной работы в изменяющихся условиях окружающей среды. Они играют ключевую роль в регуляции иммунологической защиты, в запуске адаптивных защитных реакций при инфекции, повреждении тканей, стрессе, а также в формировании патологических состояний организма, в том числе и алклоголизма [55, 76, 230]. Многие нейропептиды вовлекаются в регуляцию возрастных изменений, в т. ч. и процессов полового созревания [12, 16, 25, 94, 95].

Одним из этапов метаболизма пептидов является ограниченный протеолиз, который играет главную роль, как в процессах их биосинтеза, так и в процессах инактивации. Пептидгидролазы, осуществляющие процессинг и деградацию пептидных регуляторов, обеспечивают функционирование и определенное соотношение их в организме.

Большинство предшественников нейропептидов включают последовательности пептидов, обладающих разной биологической активностью. То, какие именно пептиды будут образовываться из предшественника, зависит от набора протеиназ, действующих на молекулу предшественника, и от соотношения их активностей [185, 242, 261, 352].

Инактивация пептидов также осуществляется путем протеолиза и характеризуется следующими основными особенностями. Во-первых, один и тот же пептид может расщепляться разными пептидазами, а один и тот же фермент может превращать различные пептиды [1, 212]. Во-вторых, в отличие от классических медиаторов, продукты деградации пептидных регуляторов могут обладать собственной биологической активностью, которая может отличаться от активности исходного пептида как количественно, так и качественно [10].

При паракринном действии пептида активность внеклеточных пептидаз определяет время жизни пептида, расстояние, на которое он может продиффундировать, а, следовательно, и спектр мишеней, на которые он действует. Таким образом, при помощи протеиназ осуществляется регуляция физиологических эффектов пептидов на этапе биосинтеза и на этапе инактивации пептидов.

Особенность пептидной регуляции функционального состояния организма состоит в том, что в каждом участке в каждый момент времени должна поддерживаться необходимая концентрация определенных пептидов. Это может быть достигнуто точной и согласованной работой протеиназ, осуществляющих синтез и деградацию пептидов, т. е. поддержанием в головном мозге определенной пространственно-временной мозаики протеолитической активности. При изменении внешних условий, или каком-либо воздействии (например, алкоголизации) эта мозаика определенным образом изменяется, чтобы обеспечить работу функциональных систем организма в новых условиях [59].

В конечной стадии образования активных пептидов из неактивных предшественников и в начальных стадиях их деградации участвуют основные карбоксипептидазы – ферменты, отщепляющие остатки основных аминокислот (аргинина и лизина) с С-конца пептидов. К ним, в частности, относятся карбоксипептидаза Н, и недавно открытая ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза. Им принадлежит важная роль в регуляции уровней активных нейропептидов в организме [35, 40, 41, 43, 47, 48, 56, 101, 102, 131, 136, 151, 160, 172, 174, 200, 204, 292], чем обусловлен интерес к изучению этих ферментов, в том числе и при различных физиологических и патологических процессах, протекающих в организме [29, 30, 32, 39, 45, 49, 50, 52, 53, 54, 139, 140, 144, 175, 187, 196, 210, 213, 236, 237, 243, 253, 273, 283, 300, 303, 308, 311, 335, 336, 339, 340, 341].

1.3.2. Карбоксипептидаза Н

Карбоксипептидаза Н (КПН, энкефалинконвертаза, карбоксипептидаза Е, КФ 3.4.17.10) впервые была выделена и охарактеризована в 1982 г. Fricker L.D. и Snyder S.H. из мозга, гипофиза и хромаффинных гранул надпочечников быка [172].

Карбоксипептидаза Н является гликопротеином с Mr 50000 – 55000, состоит из одной полипептидной цепи. Это тиолзависимый металлофермент, в активном центре которого находится ион Zn2+ [203, 204]. Фермент имеет оптимум рН 5,5-6,0