Выделение белков

о которых шла речь выше, применяют катиониты, содержащие сульфогруппы —, Например

сульфопропилсефадекс. В отличие от карбоксильных сульфогруппы сохраняют отрицательный заряд практически при всех рН, используемых в хроматографии белков.

Ионогенные группы фосфоцеллюлозы слабее, чем у сульфопропилсефадекса, но сильнее карбоксильных. Оказалось, что этот ионообменник может применяться в качестве биоспецифического сорбента при выделении некоторых ферментов фосфорного обмена.

Среди анионитов наибольшее распространение получили диэтил-амииоэтил (DEAE)-целлюлоза и ее аналоги с иными матрицами:

 

Диэтиламиноэтильная группа, присоединенная к целлюлозе или другой полисахаридной матрице.

Основность диэтиламиноэтильной группы в сорбентах этого типа несколько ниже обычной из-за влияния окружающих ее гидроксильных групп, так что ее р равен 9,5. DEAE-целлюлоза эффективна как аннонообменник вплоть до рН 8,5 — 9,0. Аниониты, содержащие четвертичные аммонийные группы, — QAE-сефадекс или QAE-сефароза— сохраняют положительный заряд и при более высоких рH.

Хроматография белков иа DAEA-целлюлозе и аналогичных аниони-тах, подобно хроматографии на катионах, определяется многоточечным связыванием отрицательно заряженных групп белка (прежде всего карбоксильных) с катионными группами ионообменника. Как и при хроматографии на катионитах, десорбции белков достигают повышением ионной силы элюирующего раствора, ее можно проводить ступенчато или с применением градиента концентрации соли. И в этом случае не рекомендуют градиенты pH и использование растворов, содержащих разные анионы. Например, при десорбции белков хлористым натрием с DEAE-целлюлозы, уравновешенной ацетатным буфером, помимо экранирования разноименно заряженных групп сорбента и белка происходит замещение удерживаемых анионитом ацетат-ионов ионами хлора. Если элюция проводится в слабокислых растворах, десорбированные ацетат-ионы, связывая протоны, вызовут сдвиг рH в щелочную сторону, что приведет к локальному изменению условий элюции и сделает процесс трудно контролируемым.

В последнее время в хроматографии белков все шире применяют ионообменники на основе гидрофильных органических полимеров, получаемых в форме шариков строго одинакового диаметра (10 мкм) и обладающих большой рабочей поверхностью. Стандартность гранул таких ионитов снижает размывание хроматографических пиков за счет различий во времени диффузии белковых молекул внутри сорбента — фактор, ограничивающий эффективность обычных ионообменников с неодинаковыми гранулами. Носители этого типа жестки, что позволяет достигать весьма высоких скоростей протекания растворов через колонку при давлении порядка 20 атм. Совместное действие этих факторов резко повышает эффективность и скорость хроматографии белков на такого рода сорбентах, получившей название быстрой жидкостной хроматографии белков (английское сокращенное обозначение FPLC). В качестве сорбентов используют Moho-Q — сильный анионит с четвертичными аммонийными группами, Moho-S — сильный катионит, содержащий сульфогруппы, или Моно-P— катионит с фосфатными группами.

Очистка щелочной фосфатазы ионообменной хроматографией:

1 - оптическая плотность при 280 ни, отражающая общее содержание белка; 2 - активность щелочной фосфазы;

А - разделения неочищенного препарата на аиионите Моно-Q при рН 8 в градиенте концентрации NaCl 0-0.35 М (3):

Б - хроматофокусирование на Моно-Р щелочной фосфатазы, очищенной на предыдущей стадии в градиенте рН (4);

В - хроматография фракции, выделенной на Моно-Р, на анионите Моно-Q в градиенте концентрации NaCl (5)

К сожалению, до сих пор не удалось разработать достаточно эффективный способ препаративного электрофореза белков в гелях, хотя их аналитическое разделение электрофорезом в полиакркламидном геле дает очень хорошие результаты и является ведущим методом в исследовании белковых смесей и индивидуальных белков.

Гидрофобная хроматография белков

 

Как известно, поверхность белковой глобулы богата гидрофильными аминокислотами, но в то же время содержит немало (до половины от их общего содержания) гидрофобных остатков, нередко образующих скопления ("гроздья"). Такие гидрофобные зоны, развитые в большей или меньшей степени, представляют характерную особенность структуры каждого белка, на чем и основан метод гидрофобной хроматографии. Соответствующие сорбенты синтезируют, включая гидрофобные группировки в гидрофильную матрицу, например в поперечно-сшитую агарозу — сефарозу. По такому принципу построены, в частности, октил- и фенилсефароза:

 

При пропускании белкового раствора через фенилсефарозу гидрофобные участки поверхности белков образуют контакты с фенильными группами, вытесняя прилегающие к этим структурам молекулы воды. Число и прочность таких контактов весьма различны у разных белков. Повышению их прочности способствует сорбция белков из концентрированных растворов солей, например сульфата аммония. Плавное понижение концентрации соли в растворе, протекающем через колонку с фенилсефарозой, приводит к поочерёдной десорбции белков.

Сходным образом действуют сорбенты, полученные присоединением к макропористому кремнезему гидрофобных алкильных радикалов

различной длины. Они, будучи жесткими, особенно подходят для работы при повышенном давлении в условиях высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, англ. HPLC). Те из них, которые содержат длинные —-уг леводородные цепи, малопригодны для разделения белков из-за слишком сильного, нередко необратимого связывания, ио могут применяться для хроматографии пептидов. Лучшие результаты дает хроматография белков на сорбентах, содержащих более короткие — С₄ — углеводородные цепи.

Нередко гидрофобная хроматография сочетается с другими эффектами. Например, присоединение к активированной бромцианом сефарозе диаминов различной длины дает сорбенты, в которых содержатся гидрофобные углеводородные цепочки наряду с двумя катионными группами. Объединение черт гидрофобного сорбента и анионита в одном хроматографическом материале обогащает его.

Описанный выше способ проведения хроматографии на гидрофобном сорбенте — далеко не единственно возможный. Для сорбции белков не обязательно введение в раствор повышенных концентрация соли, а для элюцни можно применять добавление органических растворителей, сдвиг рН. В некоторых случаях, когда связывание белка основано на сочетании гидрофобных и ионных взаимодействий, хорошие результаты дает элюция растворами солей. Отметим также, что признаки гидрофобной хроматографии встречаются и в других приемах разделения белков, в особенности в аффинной хроматографии.

Аффинная, или биоспецифическая. Хроматография белков

 

Как уже отмечалось, способы разделения белков, основанные на различиях в их физико-химических свойствах, не могут быть высокоспецифичными. С этой точки зрения гораздо перспективнее препаративные методы, которые базируются на функциональных различиях белков. Для множества белков, включая ферменты, их ингибиторы, транспортные белки, иммуноглобулины, регуляторные белки, токсины, рецепторы, — главнейшая функциональная черта состоит в способности избирательно связывать те или иные лиганды — субстраты, коферменты, аллостерические эффекторы, антигены и т.п.

Такое связывание по существу своему весьма специфично, и это свойство резко выделяет тот или иной белок из множества других. На использовании функционально обусловленной способности белков обратимо связываться с соответствующими лигандами и основан метод аффинной, или биоспецифичгсгой. хроматографии.

Для синтеза аффинного сорбента отвечающий специфичности данного белка лиганд (субстрат или его аналог при хроматографии фермента) присоединяют к инертной матрице так, чтобы возможно меньше затронуть те элементы его структуры, которые непосредственно участвуют во взаимодействии с белком. Иногда лиганд прямо вводят в реакцию с функциональными группами на поверхности матрицы, однако чаше их соединяют через промежуточное звено ("вставку", "ножку" и т.п.), чтобы отдалить лиганд от матрицы и уменьшить пространственные препятствия для его сближения с белком.

К каждому из элементов структуры аффинного, сорбента предъявляются определенные требования. Матрица должна быть инертной и не создавать стерических препятствия для белка. Чаще всего в качестве матрицы используют микропористые гели, образованные поперечно-сшитыми гидрофильными полимерами, например производное агарозы — сефарозу, синтетические полимеры или неорганические носители макропористые производные кремнезема — силикагель или стекло. Присоединение лигандов к сефарозе (непосредственно или через вставку) обычно проводят, активируя ее бромцианом. Бромциан (сильный яд!) в щелочкой среде реагирует с гидроксильными группами сефарозы, образуя весьма активный эфир изоциановой кислоты:

 

Последний взаимодействует затем с аминогруппами лиганда L или "вставки" с образованием производного изоыочевнны, которое является сильным основанием и в обычном диапазоне рН песет положительный заряд:

 

Таким образом, присоединение лиганда к сефарозе, активированной бромцианом, одновременно создает на матрице эквивалентное содержанию лиганда число катионных групп. Следовательно, такой сорбент помимо био- специфического связывания белка лигандом может проявлять свойства анионита, что необходимо учитывать при его использовании.

Известны и другие способы присоединения лнгандов к матрице, однако в каждом случае следует учитывать изменения в характере носителя, сопровождающие реакцию с лигандом, а также большую или меньшую неустойчивость образовавшейся связи, которая иногда может вызывать постепенную "утечку" лиганда. Например, изомочевина может превращаться в производное гуанидина в присутствии значительных концентраций первичных аминов или аммиака, что влечет за собой отщепление лиганда.

Сложнее требования, предъявляемые к лиганду. Он прежде всего должен достаточно сильно взаимодействовать с белком. Так, принято считать, что для получения сорбентов, предназначенных для выделения ферментов, в качестве лигандов могут быть использованы такие ингибиторы или аналоги субстрата, которые имеют константу ингибировавия (субстратную константу), т.е. константу диссоциации фермент — лиганд, не хуже 10^-4 М. При этом учитывается, что присоединение лиганда к матрице ухудшает (т.е. повышает) константу ингибирования по крайней мере на один порядок.

При подборе лигандов для аффинной хроматографии ферментов приходится изменять структуру субстрата, чтобы предотвратить возможность его превращения ферментом в продукт, например, расщепления пептидного лиганда, если речь идет о хроматографии протеиназ. Очевидно, что сорбент, содержащий в качестве лиганда истинный субстрат, будет трансформирован при первом же контакте с ферментом и окажется непригодным.

При пропускании раствора, содержащего сложную смесь белков, других биополимеров, низкомолекулярных соединений, солей, пигментов и т.п., через биоспецифический сорбент, построенный по описанной выше схеме, лнганд образует комплекс только с тем белком, который имеет участок связывания, комплементарный структуре лиганда. В результате именно этот белок удерживается аффинной колонкой, тогда как все остальные компоненты смеси проходят через нее не задерживаясь.

После промывания колонки для удаления неспецифически удерживаемых примесей белок элюируют, изменяя состав протекающего через колонку раствора так, чтобы ослабить взаимодействие белка с лигандом. Для этого прибегают к изменению рН, добавляют к элюенту неорганические соли, органические растворители. Все эти факторы, воздействуя на структуру зоны связывания лигвнда и подавляя от дельные виды белок-лиг видных взаимодействий, например ионные связи и гидрофобные контакты, обеспечивают десорбцию. В отдельных случаях прибегают к аффинной элюции раствором лиганда или его аналога. Этот прием, основанный ив конкуренции за связывание белка между присоединенным к матрице и растворенным лигандами, весьма специфичен и эффективен, но дорог.

В качестве примера рассмотрим применение циклопептидного антибиотика — грамицидина S — в качестве лиганда при аффинной хроматографии протеолитических ферментов. Он содержит ряд гидрофобных аминокислот, соответствующих специфичности многих протеиназ, и два остатка орнитина, δ-аминогруппы которых позволяют легко присоединить циклопептид к активированной бромцианом сефарозе или другим матрицам:

 

Остаток орнитина, аминогруппа, которого присоединена к активированной бромцианом сефарозе.

Грамицидин S связывает протеиназы различных классов, однако он устойчив к их действию и не подвергается гидролизу, по-видимому, из-за присутствия в структуре остатков D-фенилаланина, пролина, а также из-зa особенностей конформации циклопептида. Следовательно, грамицидин S является природным аналогом субстратов протеназ и хорошо подходит для роли лигаида широкой специфичности. Так, при пропускании через колонку с грамицидин-5-сефарозой сложной смеси веществ, содержащихся в культуральной жидкости одного из штаммов бактерии Bacillus subtilis, сорбент связывает только металлопротеиназу, которую удается полностью освободить от примесей и получить практически чистый белок.

Еще эффективнее сорбенты, содержащие такие лиганды, которые взаимодействуют не только с зоной связывания, но и с каталитическим центром фермента. Например, производные бензилянтариой кислоты оказались хорошими лигандами для выделения карбоксипептидаз — ферментов, отщепляющих аминокислоты от карбоксильного конца пептидной цепи. Сходство лигандов с субстратами карбоксипептидаз на первый взгляд невелико, однако оказывается, что группа

HООC^- способна выступать в качестве своеобразного аналога пептидной связи:

 

В результате -карбоксильная группа бензилянтарной кислоты взаимодействует с каталитическим центром фермента, а боковая бензильная группа и ошарбоксил — с компонентами зоны связывания субстрата. Образующийся комплекс лиганда, обычно присоединяемого к матрице через аминогруппу, введенную в паpаположение бензольного кольца, связывает фермент весьма прочно.

Широко используют своеобразный вариант аффинной хроматографии, основанный на применении в качестве лигандов синтетических красителей антрахинонового ряда, например цибакрона голубого;

Плоская структура, образованная тремя конденсированный и ароматическими кольцами замещенного антрахинона, к которому в положении 1 присоединены замещенный анилин и триазиновый цикл, способна избирательно взаимодействовать с целым рядом белков. Лиганд связывается, по-видимому, во впадинах, которые нередки на поверхности белков, в особенности в активных центрах ферментов. Высказывались предположения, что антрахиноны вместе с присоединенными ядрами анилина и триазина образуют структуру, стерически близкую природным лигандам, например таким коферментам, как NAD, и имитируют свойственный последним способ связывания с белками. Ввиду этого сорбенты, содержащие цибакрон голубой и некоторые другие антрахиноновые красители, особенно рекомендуются для аффинной хроматографии белков, содержащих NAD или иные соединения нуклеотидной природы.

Нет необходимости, чтобы нуклеотид или сходное по строению соединение было похоже на субстрат — оно может имитировать эффектор, регулирующий активность фермента. Так, например, хорошие результаты дает хроматография на антрахиноновых красителях аспартаткарбомилазы, где нуклеотиды выступают как аллостерические эффекторы. 

Впрочем, круг белков, связываемых этими сорбентами, значительно шире и включает, например, сывороточный альбумин. Последний легко присоединяет различные лиганды, в том числе некоторые лекарственные препараты и триптофан, который можно (с большими оговорками) считать напоминающим конденсированные кольца антрахиноиа. Структура лиганда— замещенного антрахинона — не безразлична, поэтому, используя разные красители, удается получить серию сорбентов, не одинаково связывающих различные белки.

Иммуносорбция

 

К числу наиболее специфических принадлежит взаимодействие белков с антителами — иммуноглобулинами. Это свойство с успехом используют для создания биоспецифических сорбентов, в которых роль лиганда выполняют специфические в отношении выделяемого белка иммуноглобулины. Получение и применение такого рода сорбентов происходят примерно так же, как и в обычной аффинной хроматографии, отличаясь лишь немногими особенностями. Во-первых, присоединение иммуноглобулина G к матрице необходимо проводить в щадящих условиях. Установление между молекулой антитела и носителем множества ковалентных связей (которое может произойти, если добиваться повышения емкости сорбента) благоприятствует денатурации белка и может, следовательно, привести к утрате специфичности антитела.

Во-вторых, использование обычных, поликлональных, антител, которые представляют собой весьма сложную смесь молекул иммуноглобулинов различного строения, приводит к получению сорбента, в котором содержатся антитела с широким диапазоном сродства к выделяемому белку-антигену. Это затрудняет его сорбцию и в особенности десорбцию, так как диссоциация целого набора неодинаковых комплексов антиген—антитело может потребовать вариации условий алюции в весьма широком интервале, вплоть до весьма жестких. Это осложнение снимается, если доступны моноклональные антитела, представляющие собой однородные молекулы иммуноглобулина. Десорбция и в этом случае может доставлять некоторые трудности из-за прочности комплекса, однако их удается преодолеть, подавляя нековалентные взаимодействия между выделяемым белком и иммуноглобулином при помощи изменения рН, ионной силы, добавления в элюент органических растворителей или мочевины.

Иммуносорбция особенно уместна как высокоспецифичный метод выделения небольших количеств особо ценных белков из сложных смесей, поскольку используемые сорбенты дороги и недолговечны из-за склонности иммуноглобулинов к денатурации. Очень важно, что к иммуносорбции можно прибегнуть даже в таких случаях, когда сведения о свойствах белка, в том числе и о его функции, скудны.