Выделение белков
Перспективы использования белковой инженерии для выделения белков
Методы генной инженерии позволяют присоединять к структурному гену белка последовательности, кодирующие такие белки или их фрагменты (домены), которые облегчают выделение конструкции в целом. Полученный гибридный ("химерный") белок во многих случаях, хотя и не всегда, жизнеспособен, причем обе части "химеры" не зависимо друг от друга свертываются в компактные структуры. Это дает возможность, используя характерные свойства присоединенной к целевому белку структуры, провести специфическое выделение гибрида, после чего расщепить "шарнир", соединяющий обе его части.
Так, белки-гибриды, в которых одной из составных частей является белок А стафилококков, могут быть очищены хроматографией на колонках, содержащих присоединенные ковалентно иммуноглобулины. Белок А прочно связывается с последними. Гибридные белки, в состав которых входит β-галактозидаза или ее крупные фрагменты, могут быть очищены на колонках, специфически сорбирующих этот фермент, например содержащих ковалевтно связанный аналог субстрата — амннофенилтиогалактозид. По завершении очистки гибридный белок подвергают ограниченному протеолизу или расщепляют связь между объединенными в его структуре белками специфическими химическими методами, например действием бромциана, и отделяют "целевой" белок от белка-носителя, что, как правило, не составляет затруднений.
Иногда к структурному гену белка присоединяют олигонуклеотидные фрагменты, которые кодируют короткие аминокислотные последовательности, наращивающие этот белок с аминного или карбоксильного конца. Эти последовательности выбирают так, чтобы они не препятствовали свертыванию белка и в то же время сообщали всей конструкции то или иное характерное свойство, которое позволяет легко выделить такую молекулу даже из очень сложной смеси. Затем эти фрагменты отщепляют в мягких условиях.
Так, присоединение к карбоксильному концу дегидрофолатредуктазы Lys—Gly—Ser—Arg—Ser двух остатков гистидина дает последовательность Lys—Gly—Ser—Arg— Ser—His—His. Соседствующие остатки гистидина образуют комплекс с ионом Ni2+, который удерживается специально полученным сорбентом с хелатирующими группами. Это позволяет в одну стадию выделить клонированный E.coli фермент из культуральной жидкости практически чистым, с 90%-ным выходом. Отщепление обоих остатков гистидина карбоксипептидазой А приводит к дегидрофолатредуктазе с G-концевой последовательностью Lys-Gly-Ser-Arg.
Предложено к аминному концу рекомбинантных белков-лимфокинов присоединять последовательность Asp—Туr—Lys—Asp—Asp—Asp— Аsр—Аsр—lys, которую связывает специально полученное антитело. После очистки белка (модифицированного присоединением такой последовательности) имнуносорбцией его обрабатывают энтеропептидазой — ферментом, специфически отщепляющим этот пептид. По-видимому, описанный подход особенно перспективен для выделения и очистки рекомбинантных белков.