Повышение эффективности использования гидроидов при биотестировании: выбор вида, сезона, температурного режима

Карлсен А. Г., Марфенин Н. Н.

Среди различных видов гидроидов чувствительность к повышенному содержанию в морской воде ионов цинка во много раз различается. С помощью регистрации доли рассосавшихся за 1—2 сут гидрантов у ObeUa loveni можно без применения дорогостоящего оборудования даже в полевых условиях установить наличие в воде токсических примесей (ионов цинка в концентрации 0,5 мг/л и выше). Чувствительность метода может быть повышена, если использовать материал в период начала активного роста колоний после зимней диапаузы.

В последнее время была экспериментально доказана высокая чувствительность гидроидов к различным токсическим веществам, добавляемым к морской воде (Karbe, 1972; Stebbing, 1980a, 1981), что ставит их в ряд перспективных объектов для биотестирования (Stebbing, 1980b). Поэтому возникла необходимость выявить среди гидроидов виды, наиболее чувствительные к токсикантам, и условия, при которых указанная чувствительность проявляется в наибольшей мере.

Работа в этом направлении уже была начата нами ранее (Карлсен, Марфенин, 1987). На трех видах гидроидов рода Obelia—О. loveni (Allm., 1859) О. flexuosa (Hincks, 1861), 0. geniculata (L., 1758), взятых из моря в августе, было испытано в лабораторных условиях действие различных концентраций ионов цинка и меди в морской воде. Эффект токсического воздействия регистрировали по доле дедифференцировавшихся гидрантов через 1—2 сут, сопоставляя их в экспериментальных и контрольных колониях. Тогда было установлено, что, вопервых, среди обелий наиболее чувствительный к тосикантам вид О. loveni. а вовторых, чувствительность его к токсическому воздействию повышается при возрастании температуры (от 14 к 18°).

В настоящем исследовании мы продолжили изучение сравнительной чувствительности различных видов гидроидов к ионам цинка, испытав его воздействие на более примитивных гидроидах Clava multicornis (Forskal, 1775) и Coryne tubulosa (M. Sars, 1835), относящихся к подотряду Athecata.

Кроме того, мы проверили реакцию на длительное воздействие (до 22 сут) различных концентраций ионов цинка трех видов обелий: О. longissima (Pallas, 1766), 0. loveni, 0. flexuosa, а также более высокоорганизованного гидроида Dynamena pumila (L., 1758) из семейства Sertulariidae того же подотряда Thecaphora.

Наконец, для О. loveni проведено сравнение реакции гидроида на стандартные испытываемые нами концентрации ионов цинка в разное время вегетационного сезона—в его начале (апрель) и в конце (август).

Полученные результаты позволяют сделать предварительные выводы о характере вариаций в чувствительности гидроидов к токсикантам, что поможет, как мы надеемся, избежать необоснованных экстраполяции и уточнить подход к выбору объектов для биотестирования.

Материал и методы

Основные методы описаны в предыдущих публикациях. Культивирование гидроидов в лабораторных условиях осуществляли по специально разработанному методу (Бурыкин с соавт., 1984). Рост гидроидов учитывали периодически, подсчитывая число имеющихся в колонии гидрантов. Метод определения действия ионов цинка на процесс дедифференцировки гидрантов сводился к сравнению относительного количества дедифференцировавшихся гидрантов в опыте и контроле (Карлсен, Аристархов, 1986; Карлсен, Марфенин, 1987). Относительное количество дедифференцировавшихся гидрантов определяли как отношение их числа к общему числу гидрантов в колонии к моменту наблюдения (в процентах). Общее количество гидрантов в каждом опыте было не менее 30 и, как правило, превышало 100. Самые большие выборки (200— 400 гидрантов) были в опытах, в которых определяли действие минимальных концентраций токсиканта. В этих же статьях описан способ приготовления рабочих растворов, содержавших ионы цинка в повышенной концентрации. При кратковременных наблюдениях (около 2 сут) растворы не меняли, гидроиды находились в чашках Петри в термостате. При хронических экспериментах растворы меняли 1 раз в 2 сут. Срок выбран на основании данных, показывающих, что через 2 сут 20%, а через 6 сут 80% ионов ртути “исчезает” из раствора (Baier et al., 1975). Специальные исследования поведения ионов цинка в растворе не проводили.

Статистическую обработку результатов проводили по критерию Стыодента (Лакин, 1980).

Материал собирали в разные месяцы: в марте, апреле, мае и августе в течение 1984 и 1985 гг. На Еремеевском пороге Великой Салмы Белого моря. Работу проводили на Беломорской биостанции МГУ (пос. Приморский).

Результаты

1. Действие ионов цинка на гидроидов Clava multicornis (Forskal, 1776) и Coryne tubulosa (M. Sars, 1835) (подотряд Athecata). Представители подотряда Athecata оказались менее чувствительными к действию ионов цинка, чем исследованные нами обелии из подотряда Thecaphora. Так, гидроид Clava multicornis, принесенный с моря в августе после полового размножения, сохранял жизнеспособность в растворах, содержавших ионы цинка в концентрациях 10,0, 5,0 и 2,5 мг/л в течение 39 ч (до конца эксперимента).

Колонии Coryne tubulosa, принесенные с моря в марте и постепенно адаптированные к теплой (18°) воде, наблюдали в течение 20 сут. Колонии в контрольных условиях быстро росли, увеличивалось число гидрантов. Практически так же хорошо рос гидроид в растворе с концентрацией ионов цинка 1,0 мг/л. При 2,5 мг/л колонии не погибали, но их рост не сопровождался заметным увеличением числа гидрантов, т. е. количество образовавшихся новых и дедифференцировавшихся старых гидрантов было приблизительно одинаковым (рисунок. А). При 3,0 мг/л все колонии погибали не позднее, чем через 2 сут.

Количество гидрантов в колониях, которые росли в условиях повышенных концентраций ионов цинка; А — Coryne tubulosa, Б—Obelia flexuosa, В—Obelia geniculata Г—Obelia loveni, /—контроль; концентрация ионов цинка 2,5 мг/л (2), 1,0 (3), 0,5 (4), 0,25 мг/л (5)

2. Долговременный рост гидроидов рода ObeUa (подотряд Thecaphora) в присутствии повышенных концентраций ионов цинка. Если колонии, извлеченные из моря в начале марта, когда они находятся в состоянии гипобиоза, предварительно адаптировать к теплой (18°) воде в течение 6 сут, то все они начинают бурно расти. В контрольных условиях этот рост сохраняется на протяжении всего эксперимента (15—22 сут).

В присутствии ионов цинка в концентрации 1,0 мг/л все три вида гидроидов растут хуже, чем в контрольных условиях, и через 10—12 сут погибают (рисунок, б—г). При концентрации 2 мг/л гидроиды погибают через 2 сут. При концентрации 0,5 мг/л Obelia flexuosa и Obelia longissimа растут практически так же, как в контроле (рисунок, Б, 5), а О. loveni растет хуже (рисунок, Г), хотя в течение всего эксперимента не гибнет. При концентрации 0,25 мг/л и О. loveni растет так же, как в контроле.

Если эксперимент проводить с колониями, не адаптированными предварительно к теплу, то при концентрациях 1,0 мг/л они выходят в теплой (18°) воде из гипобиотического состояния (т. е, у них появляются гидранты), но далее практически , не растут, хотя и сохраняют жизнеспособность в течение всего эксперимента (20 сут).

3. Действие повышенных концентраций ионов цинка на гидроид Dynamena pumila (подотряд Thecaphora). Рост колоний D. pumila в эксперименте был неустойчив, поэтому удалось установить только летальные концентрации ионов цинка, которые оказались выше, чем у обелий.

Длительные наблюдения за состоянием гидроида показали, что если его в марте сразу поместить в раствор с ионами цинка в период адаптации к теплой воде, то он погибает в течение 2—3 дней в растворе 3,0 и 2,5 мг/л и через 20 дней при концентрации 1 мг/л. Если же гидроид предварительно в течение 6 сут адаптировать к теплой воде и только после это го поместить в экспериментальные условия, то он, по крайней мере в течение 18 сут, сохраняет жизнеспособность при концентрации ионов цинка 2,5 мг/л.

Таблица 1

Доля дедифференцировавшнхся гидрантов (%) у Obelia loveni при 18° в разные периоды вегетации в материале из моря (*) и в лабораторной культуре (**) после увеличения концентрации ионов цинка

Примечание. Различие в 19% и более достоверно с вероятностью 95—99,9%. Меньшие различия кедосто верны,

4. Особенности регистрации токсического эффекта на гидроидах в зависимости от периода их вегетации. На наиболее чувствительном к воздействию ионов цинка гидроиде О. loveni мы сопоставили реакцию его гидрантов на повышенные концентрации ионов цинка ранней весной (апрель) и в конце лета (август), а также в марте (лабораторная культура). Мы рассчитывали выяснить, одинаковы ли вызывающие токсический эффект пороговые концентрации ионов цинка в начале и в конце сезона вегетации.

Как уже отмечалось выше, ранней весной колонии О. loveni в море еще не растут и бывают без гидрантов. Перенос их в аквариум с более теплой водой (в данном случае 17—18°) стимулирует образование гидрантов и начало роста побегов и столонов. На этом фоне перехода из одного морфофункционального состояния в другое (Марфенин, 1980) было проведено испытание токсического воздействия цинка в одной серии опытов (табл. 1, апрель). В другой серии опыты были осуществлены не сразу после переноса материала из моря в значительно отличающиеся по температуре аквариумные условия, а лишь по прошествии 1—2 нед, т. с. после того, как прошла адаптация гидроидов и культура стала лабораторной (табл. 1, март).

В августе материал для опытов брали иа моря. Различие по температуре при переносе гидроидов в лабораторию было всего в несколько градусов (от 14 до 18°).Результаты опытов, проведенных по единой методике учета доли рассосавшихся гидрантов во взятых для эксперимента побегах О. loveni, показали, что при концентрации цинка, равной 2,0 мг/л, и температуре 18° через 18—22 ч все гидранты у подопытных побегов дедифференцируются во всех случаях.При концентрации ионов цинка, равной 1,0 мг/л, доля дедифференцировавшихся гидрантов через 18—22 ч была выше в августе, а весной была выше в лабораторной культуре (табл. 1). Однако через 43—46 ч в весенних опытах доля рассосавшихся гидрантов стала выше в материале, взятом непосредственно из моря. Это означает, что через 2 сут при данной температуре и при данной концентрации ионов цинка реакция гидроидов во всех случаях приблизительно одинакова.

При меньшей концентрации ионов цинка (0,5 мг/л) токсический эффект через 18—22 ч проявился в весеннем материале, взятом из моря (апрель), и в августовском материале. В лабораторной культуре весной доля дедифференцировавшихся гидрантов в это время от контроля достоверно не отличалась. Однако через 2 сут токсическое действие ионов цинка проявилось и в лабораторной культуре, хотя доля рассосавшихся гидрантов оставалась все же более низкой, чем в материале из моря.

Таблица 2

Зависимость доли дедифференцировавшихся гидрантов (%) у гидроида Obelia loveni, взятом из моря от температуры, концентрации ионов цинка в морской воде и продолжительности опыта

* Отличия ог контроля с вероятностью 95%. ** То же, Р=99,0%.

Примечание. Опыты при температуре 18 и 22° были поставлены в мае. а при 14,5° в августе.

Данные по дедифференцировке гидрантов в эксперименте могут иметь значение для оценки токсического эффекта лишь при сопоставлении с контрольными значениями, которые сильно различались в перечисленных трех сериях опытов.Менее всего дедифференцировка гидрантов в контроле была выражена в материале, взятом весной из моря, накануне перед опытом, сильнее в лабораторной культуре и еще больше доля дедифференцировавшихся гидрантов в контроле была в августовском материале.Чем интенсивнее идет дедифференцировка гидрантов в контроле, тем сложнее использовать материал для биотестирования. Так, например, по абсолютным значениям дедифференцировавшихся гидрантов в опытах с действием ионов цинка было больше всего в августе, но и дедифференцировка в контроле была в это время самой большой. Поэтому нельзя утверждать, что в августе гидроиды более чувствительны к токсическому воздействию ионов цинка. Скорее мы приходим к обратному заключению, что именно весной, вскоре после перехода колоний в период активного роста благодаря относительно слабой дедифференцировке в контроле возможна более чуткая индикация пороговых значений токсических примесей.

5. Роль температурного режима в повышении чувствительности метода. Повышение температуры до некоторых пределов приводит к ускорению ряда физиологических процессов, в том числе у гидроидов: к ускорению роста колонии (Kinne, Paffenhofer, 1966; Tusov, Davis, 1971; Бурыкин, 1980), интенсивности дедифференцировки (Crowell, 1953) и формирования (Crowell, 1957) гидрантов, уменьшению периода ростовых пульсаций (Wyttenbach, 1974) и т. д. Поэтому мы попытались повысить чувствительность метода с помощью регистрации токсического эффекта при наиболее высокой температуре, близкой к верхней температурной границе существования этих гидроидов (табл. 2).

В мае колонии О. loveni, находящиеся в состоянии перехода из зимнего гипобиоза к активному росту, мы переносили в лабораторию и содержали при температуре 22,0°. Порог чувствительности к цинку оказался в этом случае не выше 0,25 мг/л. При 18° (параллельный эксперимент) и при 14,5° (август) пороги чувствительности гидроидов к ионам цинка оказались около 0,5 и 1,0 мг/л соответственно (табл. 2). Поэтому увеличение температуры можно рассматривать как один из путей повышения чувствительности метода.

Обсуждение результатов

Впервые достаточно высокая чувствительность гидроидов к цинку была обнаружена Карбе (Karbe, 1972). Он провел экспериментальные исследования гидроида Eirene viridula Eschscholtz, 1829, относящегося к сем. Campanulinidae, подотряд Thecaphora, и установил, что полипы чувствительны к ионам цинка при концентрации 1,5—3,0 мг/л.Вслед за Карбе английский исследователь Стеббинг (Stebbing, 1976, 1979, 1980b; Stebbing, Santiago—Fandino, 1983) подробно занялся возможностью использования гидроидов в качестве тестобъектов. Используя гидроид Obelia flexuosa (Hincks, 1861) из сем. Campanulariidae, подотряд Thecaphora, он показал, что колонии этого гидроида погибают при содержании в морской воде меди в концентрации около 0,05 мг/л, а кадмия—0,5 мг/л. Пытаясь обнаружить токсическое действие тяжелых металлов на организм гидроидов задолго до их гибели, Стеббинг стал использовать различные морфологические и физиологические показатели, например частоту образования гонозооидов (специализированных половых зооидов), скорость роста тела колонии, число зооидов в экспериментальных колониях по отношению к контролю. Таким способом Стеббингу удалось достоверно зарегистрировать эффект стимуляции роста колонии и частоты образования гонозооидов при очень малых концентрациях токсикантов (0,1 мкг/л меди и 0,05 мг/л кадмия) (Stebbing, 1980a, 1981). Этот эффект, известный ранее под названием закона АрндтаШульца, а затем “хормезиса”, был описан неоднократно для разных объектов (Stebbing, 1982). Для нас важно, что Стеббинг подробно изучил его проявление и по возможности механизм у гидроидов с целью практического использования этого эффекта для биотестирования (Stebbing et al., 1983).

Разрешающая способность метода очень велика. Тем не менее у него есть по крайней мере два недостатка. Прежде всего, “хормезис” проявляется в довольно узких рамках концентраций токсиканта. Если концентрация меди в воде уже 1,0 мкг/л и выше, то обнаружить это по увеличению частоты образования гонозооидов или по предлагаемому Стеббингом показателю скорости роста колонии уже нельзя вплоть до таких концентраций токсиканта. которые близки к летальным.Второй недостаток заключается в необходимости выращивания колонии более недели (по Стеббингу—11 сут) в исследуемой воде, прежде чем можно получить результаты для последующего анализа (Stebbing, Santiago—Fandino, 1983). Следовательно, для экспрессиндикации предложенная Стеббингом методика малопригодна.Используемый нами метод не обладает такой высокой разрешающей способностью. Так, для сравнения, по дедифференцировке гидрантов у Obelia loveni можно зарегистрировать через сутки токсическое воздействие меди при ее концентрации 10 мкг/л и выше (Карлсен, Марфенин, 1987). Однако и такая чувствительность гидроидов оказывается все же существенно выше, чем у других тестобъектов (Патин, 1982), а самое главное—используемый нами метод весьма прост, легко осуществим как в лабораторных, так и в полевых условиях, не требует больших затрат, времяемких измерений и позволяет получить результаты уже через 1—2 сут.

Метод основан